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(無題) 削除/引用 No.4763-10 - 2016/01/22 (金) 22:41:29 - み 一応言っておきますが、私はpHに問題なくて、樹脂を沈降させる遠心力で沈降する細胞やその他の成分をあらかじめ遠心除去しておけば、効率低下するとは思っていません。 なので実際に上手く行かない経験のある人や効率低下する具体的な要因を予想できる人が居たら教えて欲しいと言っているだけです。

(無題) 削除/引用 No.4763-9 - 2016/01/22 (金) 22:31:39 - み ウサギ血清から抗体精製をよくしますが、その際もかなり溶血しています。 私も確かにPBS で2倍希釈してやりますが、これは一応pHが中性付近でないと樹脂にトラップされないだろうと考えてのことで、何か阻害物質が含まれているようには思っていません。 溶血成分を沈殿にしたいようですが、タンパクなどなら沈降しないですよね？ 凝固阻害している状態ならﾌｨﾌﾞﾘﾝ塊も気にする必要ないだろうし、細胞成分を遠心除去して、PBS で希釈するか、濃いﾄﾘｽpH7.5で中性を確保して、普通にproteinG.A.で回収すれば良いと予想する。 液量少ないなら硫安とか現実的でないよね？ロス多い。 色々書いたけど全血からは精製したことないから保証はしないけど、protein G.A. と抗体の結合を阻害する可能性や実際経験した人のコメントがないなら問題ない気がする。 可能ならネズミ買うなり、医学系ならヒト採血もらって、血清回収したものと、全血したもので比較すれば良い。

(無題) 削除/引用 No.4763-8 - 2016/01/22 (金) 20:24:37 - maho 確かに、みさんがおっしゃるように、どういう機序でどの程度効率が落ちるのか がはっきりしないので私も気になります。 研究室では血清の分離不良の場合には、プロテインA/Gとの反応前に透析してというように教わってきました。しかし、多少の溶血であれば、普通にリン酸バッファーで2倍希釈後に遠沈して、上清を入れるのみで問題ないという方もいました。 今回は、全血の状態で、そこから溶血成分を沈殿できるかどうか試しましたが、通常の2000×g・15分、さらに13000g・15分では溶血成分は分離できませんでした。 例えば、リン酸バッファーで4倍程度にさらに希釈してというのでも使用可能なものか、併せて御意見をいただければとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.4763-7 - 2016/01/22 (金) 17:38:21 - み 横からの質問ですみませんが、 溶血した全血からはプロテインG/AによるIgGの精製の効率が落ちる原因は何ですか？ 単純に細胞成分（溶血した残骸も含めて）を遠心で除去して上清をプロテインGで回収するのは無理なのでしょうか？ 御存知のかた教えて下さい。

(無題) 削除/引用 No.4763-6 - 2016/01/22 (金) 17:07:49 - maho 皆様ありがとうございます。 硫安沈殿による蛋白濃縮法について経験がなく調べていました。 HDRさんが言われますように、サンプルが今回少ないことも難点かと思いました。 今回のサンプル量は全血で2mlに満たない量で、おそらく血清ではおよそ半分-60%ほどになるかと思います。 今までは何回か1ml程度の血清でIgG精製をしてきたのですが、今回は貴重なサンプルのため、できれば全血量で1-1.2ml（0.5-0.6ml血清相当）ほどの使用でできればと考えていた次第です。

(無題) 削除/引用 No.4763-5 - 2016/01/22 (金) 13:34:22 - HDR サンプルの量がわからないので何とも言えませんが、硫安か、希釈したものをprotein A/Gにかけますかね。

(無題) 削除/引用 No.4763-4 - 2016/01/22 (金) 03:39:28 - おお 硫安

(無題) 削除/引用 No.4763-3 - 2016/01/21 (木) 19:26:41 - AP 硫安で差次的沈殿を行う。

溶血した全血サンプルからのIgGの精製 削除/引用 No.4763-1 - 2016/01/21 (木) 18:58:44 - maho 質問させていただきます。 このたび、血液サンプルからIgGを精製（プロテインA/Gレジン使用）することになりました。 サンプルが血清ではなく、溶血した全血（静置しても凝血せず、遠心1000×gくらいでも分離できないため抗凝固剤入り、かつ溶血していると思います）でして、このままではプロテインA/GによるIgGの吸着効率が著しく落ちると考えております。 例えば、セルロース膜などを使用した透析などでは効果があるのでしょうか？ あるいは、他の方法で壊れた血球成分などを除去できるものでしょうか？ 調べてみると、超遠心分離という方法も考えられるようなのですが、ラボに超遠心の装置はありませんでした。 どなたかお知恵をかしていただきたく、よろしくお願い申し上げます。

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