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(無題) 削除/引用 No.4771-9 - 2016/01/25 (月) 17:42:40 - IF みなさま ありがとうございました． 予備実験を検討したいと思います．

(無題) 削除/引用 No.4771-8 - 2016/01/24 (日) 06:15:59 - おお mapk系は刺激初期に上昇するキナーゼで初期の活性化が細胞の応答に重要な役割を担っていることが示されている現象もあります。 あと競合阻害とかそれに対して何があるのかぐらいは勉強してください。そこをスルーしているような気がしますので。 SB203580はATPと競合するようなので、抜くと作用が比較的早く落ちてくるとはいえます。 HCQはその処理でMAPKを抑制するようですが、直接の阻害剤ではないですね。 いずれにせよあなたの実験でいいコンディションを探るのがベストかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4771-7 - 2016/01/23 (土) 15:46:23 - なんだかな >[Re:6] なんだかなさんは書きました : > 結局あなたが自身が予備実験して必要十分なのかを判断しないということですね。あたりまえ。 訂正：判断しないといけないということですね。なんだかなー

(無題) 削除/引用 No.4771-6 - 2016/01/23 (土) 15:44:39 - なんだかな >[Re:5] IFさんは書きました : 私の実験においても，前処理のみという方法が必要十分な条件であれば，それを採用してみます． 結局あなたが自身が予備実験して必要十分なのかを判断しないということですね。あたりまえ。

(無題) 削除/引用 No.4771-5 - 2016/01/23 (土) 09:55:01 - IF おお様 ありがとうございます． ご助言の通りだと思います． 阻害剤は，endotoxin-free waterに溶解したhydroxychroloquine（HCQ）です．TLR3の阻害剤として利用します．論文では，HCQ 5uM，１時間前処理後にpoly I:Cで18時間刺激し，IP-10 mRNAの発現を見ています．この遺伝子発現はHCQ前処理で十分抑制されているようなので，これを私の実験の内部コントロールとして試してみようかなと思案中です． また，別の論文ではNFkB阻害剤としてBay，p38阻害剤としてSB203580で１時間前処理した後に，LPS 100ng/mlで１２時間刺激しIL-6 mRNA発現を見ているものもあります．これらの阻害剤は，いろいろな論文でも前処理を数時間のみ行っているようですね． もちろん，阻害剤の標的分子に対する親和性，細胞毒性など細かな相違はあると考えます．私の実験においても，前処理のみという方法が必要十分な条件であれば，それを採用してみます．

(無題) 削除/引用 No.4771-4 - 2016/01/23 (土) 08:54:04 - おお 中年さんも触れてますが、阻害剤の性質によるでしょう。そう言うところに立ち入りたくないなら、阻害剤存在下でやればいいだけのはなしではないかと。 その阻害剤は具体的になんですか?またあなたは同じ阻害剤を使おうとしているのですか?またその論文のoutputで期待していることが何かにもよるかもしれません

(無題) 削除/引用 No.4771-3 - 2016/01/23 (土) 08:47:19 - IF 中年様 ありがとうございます． 例えば抗体製剤のようなリガンド競合・中和を想定した前処理の実験では確かに洗ってはいけませんよね． 今回の質問の阻害剤は，細胞内に取り込まれてMAPKなどを阻害するような低分子化合物を想定しております． ご意見やご経験があれば，ぜひご教授お願いいたします．

(無題) 削除/引用 No.4771-2 - 2016/01/23 (土) 07:55:46 - 中年 競合阻害剤なら洗ってはだめでしょう。細胞に取り込まれてから修飾を受けて膜透過性を失うようなものは別かもしれませんが。

阻害剤の効果は前処理だけで十分か？ 削除/引用 No.4771-1 - 2016/01/23 (土) 07:46:02 - IF いつも貴重なご助言ありがとうございます． 細胞の活性化などを検討する実験において，どのようなシグナル伝達経路が重要か，IKK複合体やMAPK阻害剤を利用して調べることがあると思います． 論文では，１時間あるいは４時間ほど阻害剤で前処理をして，それから目的のリガンド等で細胞を処理する方法を目にします．その際には阻害剤処理は前処理のみで終了なのでしょうか？具体的には前処理後に細胞を洗って，その後リガンドによる細胞の刺激を開始し，目的の刺激時間が経過したら細胞を回収することが多いのか？ということです． あるいは，細胞を回収するまでリガンド＋阻害剤で刺激・処理をつづけたほうが良いのでしょうか？ リガンドや阻害剤のバリエーションは十分承知ですが，ご助言を頂ければ幸いです． よろしくお願いします．

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