いつも参考にしてます。
E3.5マウスからTrophoblast stem (TS) cellを樹立しようとしています。
胚盤胞をマウスピペットで採取し、前日にMEF(4x10^4 cell)を播いた4wellに移し、2日後にその胚盤胞が張り付いているのを確認しました。
その後、日数経過に伴い胚盤胞が成長していくのを確認しました(直径0.5-1 umくらい)。
培養5日目に100 uL 0.1% trypsin/0.4 mM EDTAで5分間反応させ、細胞を脱凝集処理します。
その後、500 uL 70CM+1.5xF4Hを添加することでtrypsin反応を停止し、12時間後にmediumを新たな70CM+1.5xF4Hに交換しました。その後は2日ごとにmediumを交換しました。
数日経てばTS細胞のコロニーが観察されるはずですが、2週間経ってもTS細胞と思われる内皮細胞様のコロニーが観察されません、また、TSではないendodermと思われる細胞が成長しているwellがありました。
印象として、脱凝集後のwellは張り付いているMEFが多すぎて、TSが張り付く余地があるのかなと感じてます。
精通してる方がいらっしゃいましたら、アドバイス宜しくお願いします。 |
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