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(無題) 削除/引用 No.4798-20 - 2016/02/18 (木) 00:08:30 - toshi おおさま、丁寧にご教授くださりありがとうございます。 ラット培養神経細胞の溶解については、文献がJ Neurosciなどpubmedベースで結構ありましたので、バッファー組成、大まかなprotocolなどはそれに準じて調整しておりました。ラボに経験者がいないので、メソッドの行間を埋めるために、pierceの膜抽出キットのプロトコールなども参考にしましたが、bufferの多くは（当然でしょうが）これらは組成が不明のため、他の実験でもキットは最終手段としてきました。 まずは、0.1%SDSを加え, 1%DOCにしたbufferで溶解したものを、pelletや他の膜蛋白のWB検出に差があるのか（結果が安定するか）みてみます。ダメなら次は教えていただきましたように、1-2mMのDTTを加えてみたいと思います。 本日、上記のバッファーで溶かしてみましたが、肉眼で確認できる溶け残りはなくなっていたので、それが吉と出るかは不明ですが、早速pelletとともにゲルに流してみます。 また、別の現象として、泳動ゲルの下端に濃いバンド（複数の一次抗体で検出されるので非特異的？）が出るときがある（そのサンプルでは、目的蛋白のバンドはすべて薄くなっています）のですが、いままで神経組織のWBではこのような経験はないのですが、lysateをSDSで変性後もPICで阻害できなかった何らかのプロテアーゼ活性が残っていて抗原基の近くで切断され断片化した、などを考えますでしょうか？このバンドもなぜか出る時と、出ない時があります。

(無題) 削除/引用 No.4798-19 - 2016/02/17 (水) 06:15:36 - おお >20-30mMくらいのDTT これは私の感覚ではちょっとおおいいのではなかろうかと。。。１ー２mMぐらいでいいかと。多すぎるとIPのときに抗体に影響が出るかもしれないので。

(無題) 削除/引用 No.4798-18 - 2016/02/17 (水) 04:13:35 - toshi おおさま、ありがとうございます。 細胞はP100プレート（約75cm2）に1000000cellをまき、1mlのLysis bufferで回収していますので、この実験系での細胞密度としては低い方だと思っております。 Lysis bufferの塩はNaCl150mMです。ほかは、100mM Tris-HCl, 1mM EDTAを添加しています。lysis bufferには還元剤は入れていませんので、20-30mMくらいのDTTなどを加えたものも検討したいと思います。sonicationは、今回、核ドメイン蛋白などがターゲットではないので（また、膜蛋白では凝固させる場合があると聞いていたので）、ノーマークでした。確かに、文献ではおっしゃられているように、膜蛋白に対してもdetergentは1% NP40などに留め、超音波を加えているものもありましたので、ときに機械的手法も併用した方が良い場合もあるのかもしれません。 今回は、トランスフェリンレセプター（TfR1）の発現を確認したいのですが、ローディングコントロールとしてNMDAR、GABAR、AMPARなどを、今まで組織ホモジェネートでも使っていた経験から、WBしたところpelletから高度に検出されたという次第です。ちなみにTfRはpellet中には陰性でした。 あと、detergentを気になった理由としまして、プレートにlysis bufferをいれて、氷上で少し揺すっていましたところ、細胞がごそっと塊で剥がれたのち、一部が最後まで（1時間反応後でも）溶解せず残っていたことがあります。そのため、最後に何度かニードル中に通したのですが完全には解消されませんでした。通常はlysis操作により、少なくとも溶解物は肉眼で見えなくなると思っておりましたので、pelletのWB結果と関係があるのではと気になっておりました。

(無題) 削除/引用 No.4798-17 - 2016/02/17 (水) 03:57:02 - おお https://ie.fishersci.com/images/lifetech/DocTechnical/Proteomics/TS_Pierce_CellLysisHB_Supplement.pdf Thermo Scientific N-PER Neuronal Protein Extraction Reagent N-PER™ Neuronal Protein Extraction Reagent is a specialized formulation for the extraction of total protein from neuronal tissue, providing higher yields and better extraction efficiency compared to other reagents while preserving protein function. こういうのも検討されてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4798-16 - 2016/02/17 (水) 02:49:35 - おお あと打てる手は超音波処理でしょうか。〜５Wぐらいの出力で物によっては抽出がかなり改善されると思われているようです。 ＞sodium deoxycholateと1% triton X でPICを加えて とありますが、溶液中にDTTか２MEが入ってますか？もしそうでなければ入れてみてもいいかもしれません。塩濃度も書かれていませんけど。

(無題) 削除/引用 No.4798-15 - 2016/02/17 (水) 02:32:20 - おお >1000000cells/sample 容量が書いてないですが、、、５００ー１０００ulぐらいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4798-14 - 2016/02/17 (水) 02:30:33 - おお 一般的にはRIPAなどで殆どの蛋白が抽出され殆どの蛋白が検出されます。GABAなどの膜蛋白が濃いバンドと書かれていますが、それが今回のあなたが抽出したい蛋白ですか？そうでないとしたらあなたの蛋白はRIPAの遠心ごのペレットにありましたか？ もし可溶化が難しい蛋白で蛋白間の相互作用をみたいのでしたら、クロスリンクして変性条件下で溶出するなどの方法もありかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4798-13 - 2016/02/17 (水) 01:53:54 - toshi おおさま、早速にありがとうございます。 対象は組織ホモジェネートではなく、今回はラット胎児脳の培養神経細胞（およそ1000000cells/sample)を使用しています。以前にラット脳ホモジェネートからは、いくつかの膜蛋白をWBで検出したり、IPをおこなったことがあるのですが、培養細胞のlysis→WBは初めての試みです。 前述させていただきましたように、今回も、研究室のプロトコール（SDSなし）でいくつかのコントロールとしている膜蛋白はうまく検出できた回もあります。しかし、細胞溶解からのサンプル調整によって、compatibleなWB結果が得られておらず、pelletからもGABAなどの膜蛋白が濃いバンドを示しており、lysis bufferの見直し（detergentの変更など）が必要？という考えに至っております。 研究室のlysis bufferと標準的なRIPAとの違いが0.1%SDSの有無でしたので、それにより細胞膜抽出がこうも大きくぶれるのか？（何回かSDSなしでもコントロール膜蛋白がうまく検出できたこともあるので、余計に混乱してしまっているのが本心です）と考えております。 他のトピックで、膜画分を抽出するためのビオチンラベルという方法を見かけたので、最終的にはトライしてみたいと思うのですが、それ以前にきちんとしたcell lysateが取れないと話にならないと思い、何かお知恵をいただきたく、お願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.4798-12 - 2016/02/17 (水) 01:15:36 - おお ちなみに材料は何でしょうか？脳組織などでしょうか？シナプスなど蛋白が密集していて、たいとな相互作用をしているかもしれません。組織なら使った材料の重量などと、溶液の比なども気になるところです。

(無題) 削除/引用 No.4798-11 - 2016/02/17 (水) 00:47:49 - おお >[Re:10] toshiさんは書きました : > また、他のトピックなどで、SDS buffer（SDS 1-2%）で細胞を溶かしてやってみたら良いというご意見を拝見するのですが、私のように膜分画が欲しい場合にはいかがなのでしょうか（できれば、その後にIPを予定しています）。 > 変性してしまうのでIPでコンプレックスなどを見ることはまずできないと思います。また抗体もその条件では変性するでしょう。結構特殊な環境にある蛋白のようですね。RIPAバッファーなどでSDSの濃度が０．１％なのは蛋白の変性を避けるためです。ちょっと界面活性剤のスクリーニングをした方がいいかもと思いますが。CHAPSとかはどうかな。加えて塩濃度とかpH、LiClなどのマイルドなカオトロピック効果のあるものなど。なかなかそういうのをいじってもうんともすんとも言わないこともありますけど。 あまり見たことがないけどSDSのかわりにサルコシルとか http://what-when-how.com/molecular-biology/sarkosyl-molecular-biology/

(無題) 削除/引用 No.4798-10 - 2016/02/17 (水) 00:21:34 - toshi 続きの質問を失礼します。 1% TritonX, 0.5% DOCで細胞溶解したあとに遠心したpelletを、上清とともにSDS bufferにゲルに流し、同様にWBで検出しました。 結果、ペレット成分においても膜蛋白（GABA受容体）検出で濃いバンドが出ており、Lysis　bufferによる膜可溶化がこの時点で不十分と考えました。 RIPA bufferでは、他のdetergentとして0.1%SDSが足され、DOCも1%くらいに上げて溶解しているかと思いますが、SDSが0.1%では、pH7.4, 4℃では限界ミセル濃度以下で効果が弱いと思うのですが、SDS濃度を低く抑えている理由は、IPなどをその後に行いやすいため、あるいは、0.1%でも十分であるのか、ご意見をいただけましたら幸いです。 また、他のトピックなどで、SDS buffer（SDS 1-2%）で細胞を溶かしてやってみたら良いというご意見を拝見するのですが、私のように膜分画が欲しい場合にはいかがなのでしょうか（できれば、その後にIPを予定しています）。 併せて、ご意見をいただけましたらありがたいです。お願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.4798-9 - 2016/02/05 (金) 04:31:40 - toshi おおさん、ご提示ありがとうございます。 早速、読んでみます。

(無題) 削除/引用 No.4798-8 - 2016/02/05 (金) 04:02:52 - おお http://sevierlab.vet.cornell.edu/resources/CALBIOCHEM-DetergentsIV.pdf ページ６（PDFソフト上では１３ページと認識されている）あたりを御覧ください。すべてのデタージェントがCMC以上で膜を可溶化するかというとそうでもなく、HLBも重要です。

(無題) 削除/引用 No.4798-7 - 2016/02/04 (木) 21:02:56 - toshi おおさん、ご丁寧に回答くださりにありがとうございます。 他の膜蛋白（二種類でテスト）がバンドを検出できておりますので、一次抗体を変えて試してみたいというのが本心ではあるのですが、予算の関係などで他の原因を潰してからでないとお許しが出ないため、初めて行う膜抽出・可溶化の過程について見直しておりました。 まずは、おっしゃるように細胞溶解後に遠心したペレットをSDS化して保存してありますので、併せて泳動してみることにします 度々の基礎知識不足の質問で恐縮なのですが、Triton XにおけるCMC理論について、もしわかりやすい文献や記載などをご存知でしたら教えていただきたく、お願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.4798-6 - 2016/02/04 (木) 05:34:08 - おお >[Re:4] toshiさんは書きました : > この度、当該の蛋白をdetergentをsodium deoxycholateと1% triton X でPICを加えて氷上で溶解処理し、SDS 2%でサンプル調整をおこなった（そしてすぐに-20℃で保存）のですが、 SDSは低温で沈殿しやすいので、ロードするときは室温にもどしてSDSの沈殿がないか確認してから使うようにしてください。

(無題) 削除/引用 No.4798-5 - 2016/02/04 (木) 05:30:55 - おお >[Re:4] toshiさんは書きました : > おおさんのお返事にありますように、この部分は膜貫通の回数の多少では影響される部分は少ないと考えてよろしいのでしょうか？ 膜タンパク質の界面活性剤による抽出の原理は膜を可溶化してタンパク質を膜から開放してやることと、それにより露出したタンパク質の疎水性の高い部分を、界面活性剤の疎水基で覆い、水溶性にすることです。なので、タンパクに関係なく膜成分を界面活性剤で溶かしてしまえば自ずと蛋白はほとんど膜から開放されて抽出されます。 > > この度、当該の蛋白をdetergentをsodium deoxycholateと1% triton X でPICを加えて氷上で溶解処理し、SDS 2%でサンプル調整をおこなった...検出したバンドが弱いという結果でした。ローディングコントロールにおいた膜蛋白（1回膜貫通）は普通に検出できたので、...、SDS可溶化が不十分だったのか、あるいは逆に目的蛋白の分解が進んでしまったのかと考えています。 抗体の感度、もともとの発現量などがは考慮に入れなくっていいんですか？もし何らかの都合で可溶化ができてないなら、sodium deoxycholateと1% triton Xで可溶化したあと、遠心してペレットにものが来ている可能性はたかいです。SDSを加えればまず可溶化している考えていいと思います。物によっては強力なコイルドコイルなどの構造ではずれないとかありますけど、そういう場合はサイズの違うところに来たりしますので、可溶化できずにWBで検出できないということは殆ど無いと思います。 > 古い記事かもしれませんが、current protocols in neuroscience 1998 5.9.1-5.9.5のoverview of membrane protein solubilizationという文献に...複数のdetergentを組み合わせるなど考えたほうが良いのかもと考えていました。 複数のdetergentを組み合わせるとdetergentの効果としてはマイルドになったりすることもあります。お示しの文献は可溶化だけでなく、活性などの考慮もあるので、活性を残して可溶化するのが難しいという話だと思います。Triton X100などはCMC以上の濃度で完全に細胞膜を溶解しますので（ラフトや非常にタイトな膜フラクションについてはわかりませんが）、可溶化には理想的だと思います。 > > 恐れ入りますが、膜蛋白でウエスタンの検出がうまくいかない場合に、どのような部分からトラブルシューティングしていくべきか 膜蛋白でウエスタンといえど、膜蛋白であるがゆえに検出がうまくいかないのかどうか判断するところがないと意味のないトラブルシューティングになります。そこを一度考えたほうがいいです。うまく抽出できてないなら遠心したペレットに来ていることが大抵なので、そういうところも見ていけばある程度原因は絞れてきます。SDSでどうしても抽出できてないという判断なら、尿素を使うてはあります。サンプルバッファー中でボイルしてあぐった蛋白のアグリを解消するのにも使われています。 膜タンパク質に特化して検出感度を上げるなら、細胞から膜フラクションだけまず回収するといいでしょう。よくやられるのは２つほどあって、デタージェントフリーとかで細胞を破砕して、５００gぐらいで細胞核などを除いてから。１０００００gの遠心でペレットになった膜を回収する。理想的には１０００００gほしいところですが。３００００g以上でなんとか回収しているケースも有るようです。 細胞をTritonX-114でしょりして、５００gぐらいで核などを除き、４０度ぐらいに温めて遠心してTritonX-114層を分離する。疎水性の高い蛋白と膜成分はTritonX-114層に来るのでそのフラクションをWBにつかう。

(無題) 削除/引用 No.4798-4 - 2016/02/04 (木) 03:29:45 - toshi おおさん、さんしょううおさん、ご回答下さり、ありがとうございます。 膜蛋白の抽出は比較的緩やかな界面活性剤で可という記載をいくつか見たのですが、おおさんのお返事にありますように、この部分は膜貫通の回数の多少では影響される部分は少ないと考えてよろしいのでしょうか？ この度、当該の蛋白をdetergentをsodium deoxycholateと1% triton X でPICを加えて氷上で溶解処理し、SDS 2%でサンプル調整をおこなった（そしてすぐに-20℃で保存）のですが、検出したバンドが弱いという結果でした。ローディングコントロールにおいた膜蛋白（1回膜貫通）は普通に検出できたので、一次抗体の問題（希釈倍率を変えてみましたが変わらずでした）を除くと、抽出あるいは、SDS可溶化が不十分だったのか、あるいは逆に目的蛋白の分解が進んでしまったのかと考えています。 古い記事かもしれませんが、current protocols in neuroscience 1998 5.9.1-5.9.5のoverview of membrane protein solubilizationという文献に蛋白の種類により、detergentによる膜蛋白抽出効率に違いがあるとあったので、もし膜貫回数が影響するのであれば、複数のdetergentを組み合わせるなど考えたほうが良いのかもと考えていました。 ボイルによるアグリゲーションは奥が深いのですね。今までは、サンプルを5分ボイルでおこなってきましたが、今回はボイル、室温O/N、70℃・10分で比較しましたが変化はありませんでした。 恐れ入りますが、膜蛋白でウエスタンの検出がうまくいかない場合に、どのような部分からトラブルシューティングしていくべきか、基礎的なこととは思いますが、ご意見をいただけましたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.4798-3 - 2016/01/31 (日) 22:31:54 - サンショウウオ 室温でオーバーナイトインキュベートしてSDS化したり。

(無題) 削除/引用 No.4798-2 - 2016/01/31 (日) 05:17:38 - おお >[Re:1] toshiさんは書きました : > 膜貫通回数が多い蛋白＝疎水性が高く、界面活性剤で細胞からミセル化させにくいとの理解でよろしいのでしょうか？ > あるいは、SDS-PAGEの際に可溶化させにくいということが問題なのでしょうか？ 多分違うと思います。 > > 基礎的事項とは思いますが、膜蛋白が膜を貫通する回数（ドメインの個数）について、その多少により具体的にどのような点が問題（注意すべき）となるのかがよく分かっておらず、どなたかご教授いただきたくお願い申し上げます。 やはり以下に書かれているようにボイルが注意点だと思います。貫通どメンイが多いほどアグル可能性が高いといえばそうかもしれませんが、一回の貫通でも８量体とか作っていたり、他の膜貫通ドメインとタイトに相互作用していれば、アグルかもしれません。 > > また、膜蛋白にはボイルで凝集してしまうものがあるのでサンプルを37℃または60℃くらいで調整するという記載も見られたのですが、どのような機序でどのような膜蛋白がよりボイルで凝集しやすいのかをご存知でしたら併せてご教授いただきたくお願い申し上げます。 経験則から来てるんだと思いますが、あえてスペキュレーションしてみますと、ボイルにより比較的高いエネルギー状態たもたれるので、疎水部に結合しているSDSなどが一瞬でも緩んだり外れたりする隙に、疎水相互作用で蛋白同士がくっつくんではないかと思えます。 ボイルでアグルっていうのは結構昔から言われていることなので、何か仮説をたてて実験している論文は探せばあるかもしれません。

膜蛋白ウエスタンでの膜貫通回数（ドメイン数）の意味 削除/引用 No.4798-1 - 2016/01/31 (日) 04:05:59 - toshi 質問を失礼いたします。 6回膜貫通の膜蛋白発現をSDS-PAGE, WBで検出すべく、基本的な注意事項について調べているうちにこちらにたどり着きました。 蛋白の立体構造やSS結合なども蛋白ごとで異なるため単純比較は難しいのかもしれませんが、膜貫通回数が多い蛋白＝疎水性が高く、界面活性剤で細胞からミセル化させにくいとの理解でよろしいのでしょうか？ あるいは、SDS-PAGEの際に可溶化させにくいということが問題なのでしょうか？ 基礎的事項とは思いますが、膜蛋白が膜を貫通する回数（ドメインの個数）について、その多少により具体的にどのような点が問題（注意すべき）となるのかがよく分かっておらず、どなたかご教授いただきたくお願い申し上げます。 また、膜蛋白にはボイルで凝集してしまうものがあるのでサンプルを37℃または60℃くらいで調整するという記載も見られたのですが、どのような機序でどのような膜蛋白がよりボイルで凝集しやすいのかをご存知でしたら併せてご教授いただきたくお願い申し上げます。

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