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(無題) 削除/引用 No.4841-5 - 2016/02/15 (月) 10:12:50 - べきこ monさま 経験談ありがとうございます。RCAの頻度は高くないにしても、チェックしながら作成してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4841-4 - 2016/02/14 (日) 21:07:27 - mon > ちなみに実際に、E1をもつウイルスができることは、結構な頻度で起こりうるのでしょうか？ 経験上ほとんどないですが０ではないので、実験に使うウィルスのRCAの確認は必須です。 35mm dishでHelaに感染させるだけなので、時間と資金を無駄にしないため大量のウィルスを調製する前にも種ウィルス液のチェックは必ず行っています。 今まで主にCOS-TPC法で数種類作り96well 1wellから動物へ感染させるためT225フラスコx24枚まで増殖させましたが、増殖中にRCAになったことは無かったです。96wellのクローンの中には頻度は少ないですがRCAがあったことはあります。またb-Galを発現するウィルスは何回も増やしていますが、RCAの混入（発生？）はありませんね。 また全長ゲノム法で作製した五種のうち１種でRCAの混入がありました。増殖が悪い（収量が少ない）ウィルスでしたので、RCAになりやすい？？のかもしれません。もっともCOS-TPC法の方が原理的にRCAの混入が多いとは思います。

(無題) 削除/引用 No.4841-3 - 2016/02/14 (日) 18:47:45 - べきこ monさま、コメントありがとうございます。 はい。COS-TPCではなく、制限酵素できったベクターだけをトランスフェクションする方法です。 なるほど。HeLaなどで増幅が起きないかどうかを増幅した後にチェックしておけば、E1を取り込んでないことが簡単にチェックできますね。PCRに比べて簡単にチェックできますね。 ちなみに実際に、E1をもつウイルスができることは、結構な頻度で起こりうるのでしょうか？それともかなりの回数（例えば10回ぐらい）を２９３で増幅させると、まれにみれらる程度なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4841-2 - 2016/02/14 (日) 13:34:34 - mon COS-TPC法ではなく、制限酵素で切り出したアデノウィルス全長gDNAを293細胞に導入して組換えウィルスを作製する方法ですよね。 「これからいろいろな種類のベクターを作りたい」とのことなので、私ならまあ良いかと思います。 クローン化してもそれを増やす間に変異が起こる可能性もありますし。 組換えアデノウィルスの一番の問題は、RCA(replication-competent adenovirus)の混入です。 ウィルス液をDNaseで処理してE1遺伝子の有無をPCRでチェックする簡易法もありますが、HeLa細胞に使用量（あるいはその10倍量）を感染させて調べる方が良いと思います。 欠失ウィルスは基本的に悪さしないので、極微量の欠失ウィルスを見逃す可能性はありますが、組換えウィルスDNAを調製して制限酵素でcheckすれば良いと思います。 発現させる遺伝子によっては、全長gDNAでは出来ない、収量がb-Galウィルスの1/10-1/5ほどのものがあり準備に難儀した経験がありますので、ご注意を。 なお最近ウィルス作製が容易なAAVのkitが充実してきたので、実験目的によってはこちらも選択肢として検討してもよいのではないでしょうか。

アデノウイルスの増幅 削除/引用 No.4841-1 - 2016/02/13 (土) 19:23:02 - べきこ E1, E3が欠失したアデノウイルスベクターを使って２９３でアデノウイルスを作成し始めました。 ベクターを35mm dishにトランスフェクション後、すべてのウイルス上清を使って、増幅して、目的細胞に使用しているのですが、 トランスフェクション後、すべてのウイルス上清でなく、96 wellに希釈して、ウイルスのクローン化（1クローンではなくあくまで数％ぐらいまで希釈したもの）を行っておくほうが、増幅時に予期せぬアデノウイルスベクター内の欠損や最悪の場合E1の取り込みなどがおきたアデノウイルスのコンタミを排除できるためやったほうがいいとききました。 数種類のアデノウイルスを何度の使うのであれば、初めにクローン化してものを使えば、よいですが、これからいろいろな種類のベクターを作りたいので、クローン化は手間がかかるのでどうするべきか考えております。 みなさんはアデノウイルスベクターをトランスフェクション後、すべての培養上清を使用して、問題が実際に起きたことはありますでしょうか？ よろしくお願いします。

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