おおさま、まっくろん様、たていす様、コメントいただきありがとうございます。
実は私の同僚（外国の方）の実験でして、本人が数週間も困っており、ボスからも叱責されてるのをみて、何か力になれればとこちらで質問させていただきました。本人から詳しい抽出方法を聞きましたので、どうかよろしくお願い致します。
1. まず、マウスの開腹後、目的の組織（脳、肺、胸腺？、肝臓、腎臓、脾臓、皮膚、小腸）を取り出し、一つの組織につき、３つのピースをカットし、秤量します。例えば腎臓なら３等分にして重さを測る（wet weight）。小腸は長すぎるので適当な文節で３つのピースをカットして得ます。
2. その後、65℃のオーブンで一晩、組織を乾燥させ、それで得られたdry tissuesを秤量し（dry weight）、そこへ500 ulのホルムアミドを各組織に加え（同じ組織量かどうかは聞き忘れました・・）、60℃で24時間Evans Blueをホルムアミド中にextravasateさせます。
3. その後、よく転倒混和して、その上清100 ulを96 well plateに入れ、OD620およびOD740を測定します。
彼曰く、肝臓および腎臓はbloodyとのことでこれら組織のみヘモグロビンの補正（OD740, ヘモグロビンそのものの色素を除外するため）を以下の計算式で補正しているようです。
Values were corrected for hemoglobin (OD620-(1.426*OD740+0.03)).
既知の濃度のエバンスブルー試薬で検量線を作成して、そこから組織にextravasateしたエバンスブルーの量を求めているようです。
彼はマウスにPBSを還流するべきなのか、それともマウスを安楽死をさせて組織を採っていいのかわからず困っているようです。
もしみなさまの中でご経験ありましたら、ぜひご教授いただけますと幸いに存じます。
どうぞよろしくお願い致します。 |
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