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(無題) 削除/引用 No.4860-7 - 2016/02/22 (月) 14:11:07 - 節約大魔王 まさしもの様、重ねてお礼を申し上げます。 大変多くのことをご教示くださり、ありがとうございます。 > それぞれの培地を自作する場合は、下記論文をご参考に。 昨日ボスに相談したところ、まずは市販のものでやってみて、実験が落ち着いたら、考えてみようか、とのことでした。まずは市販のものでパッセージ、MSC誘導、テラトーマ形成まで行ってみます。教えていただき、ありがとうございます。mTeSR1の組成もわからず使っていましたが、勉強してみます。 > 未分化な状態を維持していることと多分化能を維持していることは別の問題です。 > 未分化マーカーを発現していたとしても、EBやテラトーマの形成に問題がある株もありますし、その場合はそれらの株は使用しません。 なるほど、納得です。研究所のiPSC作製部門で作られたものです。両親、患者それぞれから5クローンずつのiPSCを樹立してもらいました。テラトーマ形成実験はそのうち１クローンでのみ試しただけで、今培養しているのは２クローン目のものです。ひとまずこのクローンからはEBは作製できている様です。MSCへの分化誘導が安定的にできましたら、テラトーマ実験も再開してみます。 > テラトーマ形成が出来ることがわかっている細胞株を用いても上手く行かないのか（テラトーマもEB形成によるMSCへの分化も）、一度確認してみてはいかがでしょう。 そうですね、一度研究所のコアの人に聞いて、譲渡していただけるか聞いてみることにします。ありがとうございます。 > むかしむかし、ヒトES細胞をフィーダー細胞上などで培養していたときは、未分化なコロニーだけを拾ってくるために顕微鏡下で針先とか細くのばしたパスツールピペットでコロニーを細かく分画して、p200とかのピペットチップで剥がして継代したものです。 > そういう意味では、ラボマネージャーの人がp200で細胞を剥がすことは問題ではないです。 > ヒトES細胞やiPS細胞はシングルにするとあまりよくないので、ある程度のクランプの状態で継代や移植したほうがよいです。p200で剥がした細胞をシングルにせずそのまま移植すればよくなるかもしれません。 そうだったのですね・・だとするとテラトーマができないのは、クランプのまま移入したことが原因というよりはクローンそのものに問題があるのかもしれませんね・・。 また、シングルセルだとviabilityが低くなるだとか、継代方法だとか改めて確認できてよかったです。たくさんアドバイスをいただき本当にありがとうございます。 > 細胞の状態がよければ培地で懸濁した細胞を移植しただけでもテラトーマは形成できますが、matrigelと一緒に移植すると体温でゲル化するので、細胞の生着がよくなることもあるようです。 次回はmatrigel（+ROCK inhibitor）と一緒に打つことにします。 明日、ペトリディッシュ上のEBをGelatinコートdishに移します。これまで、MSC様の細胞がEBsからbuddingすることは確認できていたのですが、5日もするとhigh densityすぎるのか、EBsの外縁の細胞がドタバタ死んでいき、細胞内に空砲を認められるMSCとはとても思えない細胞に変わることを経験しています。今週はつきっきりでMSCが誘導されるか、いつbudded MSCsをpassageするかの見極めに慎重に取り組むことにします。重ねてありがとうございます。また、何かありましたらご相談させていただけますと嬉しく思います。

(無題) 削除/引用 No.4860-6 - 2016/02/20 (土) 17:04:05 - まわしもの それぞれの培地を自作する場合は、下記論文をご参考に。 TeSR1 doi:10.1038/nbt1177 E8 doi:10.1038/nmeth.1593 未分化な状態を維持していることと多分化能を維持していることは別の問題です。 未分化マーカーを発現していたとしても、EBやテラトーマの形成に問題がある株もありますし、その場合はそれらの株は使用しません。 テラトーマが形成できないのが、手技の問題なのか細胞の問題なのかをはっきりしないといけません。 テラトーマ形成が出来ることがわかっている細胞株を用いても上手く行かないのか（テラトーマもEB形成によるMSCへの分化も）、一度確認してみてはいかがでしょう。 むかしむかし、ヒトES細胞をフィーダー細胞上などで培養していたときは、未分化なコロニーだけを拾ってくるために顕微鏡下で針先とか細くのばしたパスツールピペットでコロニーを細かく分画して、p200とかのピペットチップで剥がして継代したものです。 そういう意味では、ラボマネージャーの人がp200で細胞を剥がすことは問題ではないです。 ヒトES細胞やiPS細胞はシングルにするとあまりよくないので、ある程度のクランプの状態で継代や移植したほうがよいです。p200で剥がした細胞をシングルにせずそのまま移植すればよくなるかもしれません。 細胞の状態がよければ培地で懸濁した細胞を移植しただけでもテラトーマは形成できますが、matrigelと一緒に移植すると体温でゲル化するので、細胞の生着がよくなることもあるようです。

(無題) 削除/引用 No.4860-5 - 2016/02/19 (金) 14:51:13 - 節約大魔王 まわしもの様、コメントを引き続きいただき、重ねてお礼申し上げます。 組成が公開されているとは知りませんでした、検索したら以下の論文にたどり着きました。 ttp://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11626-010-9297-z また、Essential 8 FlexおよびStemFitといったmediumをご紹介くださりありがとうございます。Thermoの方はアメリカからでも買えそうですが、味の素の方は購入できるかわかりませんでしたが、明日もう一度確認してみます。これまで土日も同じ時間にラボに行ってfeedingしていました。 実はこれまでラボマネージャーさんにiPSCの実験は一任しておりました。 昨年の10月頃よりiPSC実験を始めて未だにデータは出ておりません。ちょっと話が脱線してしまいますが、周りに聞ける方がおられないので、（私のラボだけがiPSC実験を行っています。）もしお時間がありましたら併せてコメントをいただけますと幸いに存じます。 私のhiPSCは対象患者さんの皮膚線維芽細胞を初期化したものです。iPSCであることのvlaidationは研究所内のiPSC作製部門によりSSEA4, TRA-1-60陽性であることのみが確認されております。これまでラボマネージャーの方がなんどもNSG（NOD-SCID, IL2Rgamma -/-）マウスにiPSCを移入し、テラトーマを形成させようとしているのですが、6匹打ち込んで一匹も腫瘍を形成しておりません。ラボマネージャーは手間を惜しんで通常LeReSRを使うところを、p200チップでiPSCコロニーを掻き取り、ピペッティングでシングルセルにしたものを移入していたようです。 たぶんそれではshear stressで移入前に死んでしまっているのではと想像しています。今後LeReSRで剥がしたものをmTeSR1かPBS（？）などに優しく懸濁したものをそっと移入しようと思っていますが、それだけでテラトーマは形成されるでしょうか？ もう一つはin vitro differentiation assayで、embryos body（EB）を形成させたのち間葉系幹細胞へと分化誘導させたいのですが、EBはできているようなのですが、それをGelatinコートdishに撒くと3, 4日以内にMSC-likeな細胞がbuddingしてくるのですが、一週間ほど様子を見ているとMSC様の細胞の形態が変わり、細胞内に大きな空胞を持つ細胞へと変わってしまい、増殖も極端に落ちやがて増殖しなくなってしまいます。MSC-likeな細胞がEBからbuddingしたことが確認できれば速やかにトリプシンで剥がして継代した方がいいでしょうか？ iPSCに精通された方からコメントをいただけたので、ついトピックと関係のないことを聞いてしまいましたが、もしお時間がありましたらご教授いただけますと大変嬉しく思います。何度も質問を重ねてしまい、恐縮しております。

(無題) 削除/引用 No.4860-4 - 2016/02/19 (金) 14:14:58 - まわしもの ひとつ忘れてました。 mTeSR1もE8も組成が公表されているので、一番安上がりなのは自分で調製することです。 E8の論文で記載されていますが、BSAとBMEは不要なのでmTeSR1からこの2つを除いた培地でもOKです。 海外在住ということなので、ラボに腕のよいテクニシャンがいれば頼んでみてもよいかと思います。 たしか市販品の1/10以下でできます（材料費のみで）。 問題は、調製したロットは必ず品質チェックを行う必要があることです。 手間を惜しむか、お金を惜しむかですね。 ThermoのEssential 8 Flexや味の素のStemFitは培地交換の頻度を減らすことができる培地として売っていますし、mTeSR1でも土日を休めるプロトコールを作っていますね。 培地交換の頻度を減らせるだけでも、節約にはなります。

(無題) 削除/引用 No.4860-3 - 2016/02/19 (金) 13:44:27 - 節約大魔王 まわしもの様、ありがとうございます。 実は海外に住んでおりまして、mTeSR1を使用するように、とhiPSCを樹立してくださったコアリソースの方に言われておりました。アメリカでは$250でmTeSR1 (500 ml)が購入できます。今ではいろいろな種類の培地があるのですね。まわしもの様が思われる費用対効果の良い培地でお勧めありましたら教えていただけないでしょうか？ > あとは、一度の実験で使用する細胞と廃棄する細胞の兼ね合いを考えて、そんなに細胞を使用しないのであれば、48-wellとか24-wellで維持することも節約できます。 確かにそうですね。今は通常の継代は6-well plateの１-wellで行っていましたが、これを24や12に変えてもいけそうですね。増やす必要がない場合にはぜひその方法を検討したいと思います。ありがとうございます。 > ちなみに、私は6-wellなら1.5ml、24-wellなら350ulくらいで培養していますが、例えば6-wellで1mlだと少なすぎて中央がかなり液高が低いですよね？ 培地に老廃物の希釈の意味合いがあることは気づきませんでした。ありがとうございます、では明日から1.5 mlで培養していこうと思います。これだけでも2 ml -> 1.5 mlなので25%も節約できそうなので、まわしもの様からコメントをいただくことができ、よかったです。 最初に matrigelだけコートした空の6-wellにiPSCを撒く際は2 ml/wellでまいていましたが、その後のfeedingは1 mlでここ数日行っていました。その際、古いmediumを1 ml全て吸引するのではなく、ある程度のleft-overを残しておりました。が、これも老廃物の希釈という意味ではよくありませんね。明日から1.5 mlにすることにします。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4860-2 - 2016/02/19 (金) 10:57:35 - まわしもの mTeSR1でなければいけない理由はあるのでしょうか？ 他のメーカーでもhiPSC用の培地は売ってますし、卸業者次第ではmTeSR1より安く納入できるものもあるはずです。 また、最近だと毎日交換しなくてもよいことを売り文句にしている培地も数種類出てきましたよね。 培地の検討も視野にいれてみてはどうでしょう。 あとは、一度の実験で使用する細胞と廃棄する細胞の兼ね合いを考えて、そんなに細胞を使用しないのであれば、48-wellとか24-wellで維持することも節約できます。 ちなみに、私は6-wellなら1.5ml、24-wellなら350ulくらいで培養していますが、例えば6-wellで1mlだと少なすぎて中央がかなり液高が低いですよね？ 培地は栄養物の供給だけではなく分泌物の希釈の意味もあるので、あまり培地の量が少ないと細胞への影響が大きくなる懸念もあります。

高価な細胞培地（h-iPS細胞）／６ウェルに必要な量 削除/引用 No.4860-1 - 2016/02/19 (金) 09:11:28 - 制約大魔王 今ヒトiPS細胞の培養を始めました。細胞培地はフィーダーフリーでも培養可能なmTeSR1培地で、大変高価なものです。（500 mlで6万円） ６ウェルプレートで培養していますが、１ウェルに通常2 ml使用しています。毎日の培地交換は未分化維持に必須です。 そこで1ウェルあたりの量を減らせないか考えています。単純に2 mlを1 mlにすれば、倍長く細胞培養を行えます。どうせ毎日培地を交換するのであれば、1 mlでも問題ないのではないかと思っています。現に今、条件検討で1 mlのものと2 mlもので比較しています。以前の予備検討では1.5 mlでも問題ないことが分かっています。みなさんならどのように節約しますでしょうか？

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