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(無題) 削除/引用 No.4907-16 - 2016/12/22 (木) 12:58:10 - IHC? すいません 一つ質問させてください RT効率が遺伝子ごとに違ったからと言ってそれが何なのでしょうか？ 一つの遺伝子についてサンプル間のRT効率が同じであれば問題ありません むしろRNAを検量線にしてしまえば、RNA濃度の違いによるRT効率の違いがcDNA濃度を測定する技術であるPCRの結果にまで影響してしまいます だからこそqPCRでRNAを鋳型にするone-STEP PCRのはウイルス学などの分野でしか行いません。また、MIQEにもone stepに対する規定はほとんどなく今後の課題と書かれているはずです（MIQE必須事項のNoRTをどう調製するのですか？） 従って検量線はcDNAの段階希釈系列であるべきだと思うのですが？ （あと濃度既知である必要はありません） ふみさんのおっしゃる通り�刧僂t法ははっきりいってオワコンです ブレがひどいからです。そこはボスを説得してください ところで >サンプル間でのレファレンスのばらつきについては確認できたので、これで補正する事にします ですが、サンプル間でリファレンスがばらついている（しかも一つしか検討していない）これはMIQE上完全にOUTですよ サンプルタイプによってリファレンスがばらつくのならば、それはリファレンスではありません。あと複数のリファレンスを検討し、真のリファレンスを発見しなければならない。これもMIQE上必須です MIQEに書いてある通り、現状の科学技術ではRNA濃度の測定結果はばらつきます。ここをどう一定にしてRT反応に持ち込めるかが、定量性を確保する腕の見せ所で一番のポイントです。 ちょっとトピ主さんの >サンプル間でのレファレンスのばらつきについては確認できたので、これで補正する事にします を読んでその点不安になりました

(無題) 削除/引用 No.4907-14 - 2016/03/17 (木) 08:13:55 - おお >[Re:13] qPCR初心者さんは書きました : > ふみ様 > > qRTPCRの基本原理も含め、とても有意義なご意見どうもありがとうございました。とても参考になりました。私の仕事は、実験結果にもとづきqRTPCRでどこまで可能かを上司に提案するところまでで、RNAで検量線を引いてアプローチするか、手法をELISAに変えるか、 ちょっと飛躍しすぎてるのでは。。。

(無題) 削除/引用 No.4907-13 - 2016/03/17 (木) 06:00:11 - qPCR初心者 ふみ様 qRTPCRの基本原理も含め、とても有意義なご意見どうもありがとうございました。とても参考になりました。私の仕事は、実験結果にもとづきqRTPCRでどこまで可能かを上司に提案するところまでで、RNAで検量線を引いてアプローチするか、手法をELISAに変えるか、については上で判断する事になると思います。個人的にはELISAに移行する方向になるような気がしていますが、せっかく習ったqRTPCRなので、何らかの形で使えないかな、とも思っています。

(無題) 削除/引用 No.4907-12 - 2016/03/15 (火) 18:04:47 - ふみ RT効率は溶液中で競合する配列によっても変わるかもしれないですが、原理的にはRNAの標準液の方がよいのだろうと思います。 ただ、現実的には、RT-PCRの信頼性を突き詰めるよりも、タンパク質についても分析する等の方向でデータセットの信頼性を高めようというやり方のほうがよくあるように思います。 すっきりとした返事でなくてごめんなさい。

(無題) 削除/引用 No.4907-11 - 2016/03/13 (日) 05:32:23 - qPCR初心者 おお様 おっしゃる通りと思います。RTではランダムヘキサマーを使っていますが、遺伝子間で逆転写の効率に差があるだろう事は想像できます。気になるのは、遺伝子の違いの他にも、逆転写に影響する因子が色々あるだろうという事で、遺伝子の違いによる逆転写効率のばらつきと、その他の要因によるばらつきをきちんと評価しないとRTPCR自体の信頼性が確認できないような気がしたのです。RNAの希釈系列を用いて、RT込みで検量線を引けば、この問題が解決するのではと考え、No.4907-9で追加の質問をさせていただきました。 私がこの２週間ほどqPCRを教えてもらっている研究室の先生方に聞くと、オリゴdT単独、あるいはランダムヘキサマーとオリゴdT併用の場合と、ランダムヘキサマー単独の場合との比較検討の結果、レファレンス遺伝子および他のいくつかの遺伝子で差がなかったとの事です。原理的にmRNAへの選択性が高い一方で３末端に偏った逆転写が予想されるオリゴdTと比べて差がないという結果にはちょっと驚きましたが、この結果からその研究室ではランダムヘキサマー単独でRTする事にしたとの事です。ただし、現在私が調べている５つの標的遺伝子については検討していないので、今度やってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4907-10 - 2016/03/13 (日) 03:40:27 - おお >[Re:8] qPCR初心者さんは書きました : > どうもありがとうございます。とても勉強になります。 > > おお様 > RT効率の不確実性については、レファレンス遺伝子についても同様なので、ここをつめるとレファレンスを用いた相対的なqRTPCRそのものが否定されてしまう気もするのですが。。。それ故に検量線を用いるべきという事でしょうか？ 例えばですよPolyAから逆転写して、あなたが見ようとしている一つの遺伝子は上流１００bぐらいにプライマーが設定してあってもう一つが都合によって１kbぐらい上流で、運悪くRTの反応があまり進まない構造をとっていたとしたらどうでしょうか？最初の遺伝子は９９％ぐらいRTされて、後者は３０％ぐらいかもしれません。 ランダムプライマーであっても、均等にプライミングが起こっているかとかいろいろ見えないところがあるので、やはりRTの効率は遺伝子間、位置などでばらつきがあってもおかしくはない。 サンプル間のばらつきは、どの程度検討されているかわかりませんが、同じように調製したサンプルからインターナルコントロール補正後再現性よい結果が得られる状況で判断がつくと思います。たとえば同じRNAサンプルをポりAとランダムでやって比べたら、結構ばらつくんじゃないかなとか想像してます。

(無題) 削除/引用 No.4907-9 - 2016/03/12 (土) 23:54:33 - qPCR初心者 ふみ様 すいません。もう一点質問してもよろしいでしょうか？ おお様のコメントも踏まえると、標準液はRT前のRNAサンプルの時点で設定すべきように思う（既知濃度のRNAを準備する事の技術的コスト的問題を無視して理論のみで考えた場合）のですが、非現実的でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4907-8 - 2016/03/12 (土) 19:27:55 - qPCR初心者 どうもありがとうございます。とても勉強になります。 おお様 RT効率の不確実性については、レファレンス遺伝子についても同様なので、ここをつめるとレファレンスを用いた相対的なqRTPCRそのものが否定されてしまう気もするのですが。。。それ故に検量線を用いるべきという事でしょうか？ ふみ様 私も試しに計算してみて、かなり差が出る事がわかり、ちょっと無理そうな気がしてきました。濃度既知の標準液を準備する方向で相談してみる事にします。

(無題) 削除/引用 No.4907-7 - 2016/03/12 (土) 11:30:03 - ふみ 例えば、増幅効率が85%, 90%, 95%, 100%の場合20 cycleで何倍に増えるかというと、それぞれ1.3 x 10^5, 3.8 x 10^5, 6.3 x 10^5, 10.5 x 10^5です。 結構違いますね。 (1) dCT法は遺伝子間のmRNA量比較には使わない。 (遺伝子間の発現レベルの違いに対して増幅効率の違いが相対的に小さいときには使えるだろうと私は考えます。一方で、検量線と濃度既知標準液を用いる方法をなぜ使わないのかという人が多いだろうと思います。) (2) 標的遺伝子のPCR産物を精製して吸光度等で濃度を測ってから、PCR産物の濃度と蛍光強度の関係を明らかにして、蛍光強度が閾値となるサイクルでのPCR産物の濃度を推定すればよいのではないでしょうか。 これをしなかったら、「PCR産物長と蛍光強度が単純な比例関係にあるのか」という批判に答えられないと思います。

(無題) 削除/引用 No.4907-6 - 2016/03/12 (土) 08:58:40 - おお RTの効率なども各遺伝子で違うかもしれないので、同一サンプル内で各遺伝子間の比較がどこまで意味があるかわかりません。

(無題) 削除/引用 No.4907-5 - 2016/03/12 (土) 04:34:15 - qPCR初心者 どうもありがとうございます。 検量線の実験を再度行い、お示し頂いたサイトにならって増幅効率を計算したところ、レファレンスで91%、５つの標的遺伝子では、95%、94%、92%、85%、83%となりました。検量線を用いた相対定量により、サンプル間でのレファレンスのばらつきについては確認できたので、これで補正する事にします。 次に、５つの標的遺伝子の発現ですが、一つの標的遺伝子の発現をサンプル間で比較する場合は、その標的遺伝子の発現を検量線で求め、レファレンスで補正すればよいのですが、同一サンプルで５つの遺伝子の発現レベルを比較するところでつまづいています。検量線はコピー数既知のプラスミドではなくサンプルの希釈系列を使っているので、検量線による定量比較はできません。指導の先生からは「deltaCt法で」と言われたのですが、増幅効率の差が明らかなので、困っています。申し訳ないのですが、もう少し質問させてもらえますでしょうか？ （１）レファレンスと標的遺伝子で増幅効率が異なる場合、deltaCt法は使えないように思うのですが、一方でレファレンスと標的遺伝子の増幅効率が完全に一致するケースもまれと思われます。deltaCt法を用いる場合、レファレンス／標的遺伝子間の増幅効率のぶれがどの程度までなら許容範囲と思われますか？ （２）Ct値と増幅効率から、テンプレートのコピー数を相対的に定量できる気がするのですが、蛍光が閾値に達した時のコピー数が遺伝子間で同一と見なせるかどうか、PCR産物のサイズによると思われ、ちょっと自信がありません。PCR産物のサイズからCt値におけるコピー数を補正し、増幅効率で逆算してテンプレート（０サイクル）における相対的コピー数を計算するのは、定量法としてどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4907-4 - 2016/03/10 (木) 10:19:57 - おお https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/qpcr-education/real-time-pcr-troubleshooting-tool/gene-expression-quantitation-troubleshooting/poor-pcr-efficiency.html

(無題) 削除/引用 No.4907-3 - 2016/03/09 (水) 18:11:44 - qPCR初心者 おお様、どうもありがとうございます。 増幅効率の標準的な表記法を知らない（勉強不足ですいません）ので、確認させていただきたいのですが、増幅効率８０％という事は、テンプレートを１として、１サイクルで８０％が増幅されて1.8になるという理解でよいでしょうか？ 検量線を用いる場合、その直線性の検定として、例えばピアソンのR二乗値を用いた場合、具体的な許容範囲（例えば0.98以上、とか）についてはどの程度と考えるべきでしょうか？ 初歩的な質問の繰り返しで申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.4907-2 - 2016/03/09 (水) 11:48:37 - おお >（１）サイクルあたりの増幅効率が悪い場合、どの辺りまでを許容範囲と考えるべきでしょうか。例えば、1.5くらいでも、直線的な検量線が書ければよいのでしょうか。 http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html こちらのトラブルシューティングではPCR efficiency is too low (<80%)となってますね。 >（２）レファレンスとターゲットで増幅効率が異なる場合、 検量線を使ってください。

qPCRの増幅効率と定量法 削除/引用 No.4907-1 - 2016/03/09 (水) 04:56:34 - qPCR初心者 野生型および変異型のマウス組織から抽出したRNAを用いてcDNA合成し、５つの異なる標的遺伝子の発現をqPCRで調べる実験を始めたばかりの初心者です。レファレンスの遺伝子１つを含めて、計６種類のプライマーペアーを準備し、SYBR greenでqPCRを行っています。 cDNAサンプルの希釈系列を用いて、相対的な検量線を引いてみたところ、直線的な分布にはなったのですが、増幅効率が遺伝子によって異なり、２よりかなり低い遺伝子が幾つか見られました。１サイクルあたりの増幅効率が1.5から1.9の間でばらついています。このような場合の対応について、初歩的な疑問点が幾つか出てきました。 （１）サイクルあたりの増幅効率が悪い場合、どの辺りまでを許容範囲と考えるべきでしょうか。例えば、1.5くらいでも、直線的な検量線が書ければよいのでしょうか。理論的にはコントロール（野生型）に対する変異型のマウス組織での相対発現量を定量できるとは思うのですが、これだけ増幅効率が低い場合は、プライマーを作り直すなどした方がよいのでしょうか？ （２）レファレンスとターゲットで増幅効率が異なる場合、単純にレファレンスのCt値をターゲットから引き算して、という訳には行かないと思うのですが、検量線上で野生型のサンプルに対して相対化された発現量を計算（レファレンスとターゲットそれぞれ）し、ターゲットの発現量をレファレンスで割れば、補正された相対発現量と考えてよいでしょうか？　 ご指導のほど、よろしくお願いします。

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