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(無題) 削除/引用 No.4918-16 - 2016/05/04 (水) 23:39:57 - HA みなさまお世話になっております。 最終的に、DNAの抽出方法とPCRのプログラム全体を調整した結果、再度同じプライマーで目的のジェノタイピングPCRが再現できるようになりました。 変更点 DNA抽出方法 KAPA　Genotyping kit　→　EZNA kit PCRプログラム変更 お知恵を拝借した皆さま誠にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4918-15 - 2016/04/01 (金) 00:28:06 - HA 皆様大変お世話になっております。 pprさん ご回答いただきありがとうございました。 1. 一度に2本を同時に増やしているなら、1本ずつ試す プライマーセットを分けて試しましたが、できませんでした。 2. アニーリングの温度を50℃まで振ってみる Tmを50から60までと、45から55まで行ってみましたが、低い温度では100bpあたりに複数のBandが出てきてしまいました。 3. 伸長時間を90-120secまで増やしてみる 伸長時間90と120を行ってもできませんでした。 4. Kapa以外の酵素を使用してみる Amplitaqを試みたところ、やはりできませんでした。 上記の複合で、3（120sec）と4（Amplitaq）で行ったところ元の親マウスからのサンプルには綺麗に目的のWTとMUT両方のバンドがでました。 しかしその子マウス等からのDNAからはWTのバンドも出ませんでした。 両者のDNAは同じ時に同じ方法で抽出しました。 Nanodropにて計測したところ親のマウスDNAは約400ng/ulで子マウスDNA等は約200ng/ulでした。また両者ともに260／280は約1.8でした。 200ngもPCRには十分な量だと思うので、量が原因で子マウスからのDNAのPCRが働かいないとは考えにくいのですが。 みさん、bluehornetさん ご回答いただきありがとうございました。 新たなプライマー作成を検討しています。

(無題) 削除/引用 No.4918-14 - 2016/03/30 (水) 09:42:51 - bluehornet 僕も、pprさん、「み」さんの提案の通り、アニーリング温度を検討するのが良いと思います。 KAPAのポリメラーゼは改変したTaqの様ですが、「Taqを用いる場合のアニーリング温度はまずTm-5℃を試す」という記述を見ますので、お示しのプライマーのTmに対して60度のアニーリング温度は高すぎると思います。プライマーが十分にアニーリング出来ていないと考えられます。 アニーリング温度を下げるか、プライマーを長くしてTmを上げるかのどちらかだと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.4918-13 - 2016/03/30 (水) 08:55:44 - み >[Re:11] HAさんは書きました : > > KAPA Mouse genotyping kit を用いています（以前までは働いていました）。 > 以下の設定で以前まで働いていました。 > > 1;95度　120秒 > 2;95度　30秒 > 3;60度　30秒 > 4;72度　60秒 > > 2-4;34回 > 5;72度　300秒 > > For ever > > ＞何bpの産物を得ようとしているのか。 > 950bp > 600bp > > ＞プライマーのTm値、長さ何mer > Primer 1;Tm 58 17mer GC% 70.6 > Primer 2;Tm 55.7 24mer GC% 58.3 > Primer 3;Tm 52.3 24mer GC% 50 > パッとみた感じ、primer1が17bpで短いので長くする。 アニーリング温度を下げる。 酵素を他の物に変える。 私ならこの辺りを検討するかな。

(無題) 削除/引用 No.4918-12 - 2016/03/30 (水) 07:44:51 - ppr >[Re:11] HAさんは書きました : > ＞何bpの産物を得ようとしているのか。 > 950bp > 600bp > > ＞プライマーのTm値、長さ何mer > Primer 1;Tm 58 17mer GC% 70.6 > Primer 2;Tm 55.7 24mer GC% 58.3 > Primer 3;Tm 52.3 24mer GC% 50 TMに幅が有り、Primer 1についてはGC含量も高いのであまりよい組み合わせではないように思います。 また、アンプリコンが結構長いですね。 そのせいで、酵素のロットの影響を受けやすいようにも感じます。 現時点で、プライマーを設計し直すのが確実だと思いますが、今出来る案として。 1. 一度に2本を同時に増やしているなら、1本ずつ試す 2. アニーリングの温度を50℃まで振ってみる 3. 伸長時間を90-120secまで増やしてみる 4. Kapa以外の酵素を使用してみる

(無題) 削除/引用 No.4918-11 - 2016/03/29 (火) 23:42:47 - HA Tomonkyさん ヒートブロックの温度は、適切でした。 みさん ご回答いただきありがとうございました。 ＞根本的にPCR試薬はどれを使用しているのか。 KAPA Mouse genotyping kit を用いています（以前までは働いていました）。 https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/pcr-2/kapa-mouse-genotyping-kits/ ＞PCR温度設定を書き出して下さい。 以下の設定で以前まで働いていました。 1;95度　120秒 2;95度　30秒 3;60度　30秒 4;72度　60秒 2-4;34回 5;72度　300秒 For ever ＞何bpの産物を得ようとしているのか。 950bp 600bp ＞プライマーのTm値、長さ何mer Primer 1;Tm 58 17mer GC% 70.6 Primer 2;Tm 55.7 24mer GC% 58.3 Primer 3;Tm 52.3 24mer GC% 50 です。 ＞Genotypingが目的なんだから遺伝子ターゲッティングの情報を得て、自身で新たなプライマーセットを設定するなりして複数の方法を作製する努力をしても良い。 論文でも書かれていたため、マウスを頂いたLabからのプライマーに固執してしまっていました。 新たなプライマーセットを設定する努力を致します。 ありがとうございました

(無題) 削除/引用 No.4918-10 - 2016/03/24 (木) 14:04:43 - み Genotypingが目的なんだから遺伝子ターゲッティングの情報を得て、自身で新たなプライマーセットを設定するなりして複数の方法を作製する努力をしても良い。 もともと微妙な（繊細な）条件でしかかからないPCR条件だったかもしれないし。。。

(無題) 削除/引用 No.4918-9 - 2016/03/24 (木) 14:01:11 - み 根本的にPCR試薬はどれを使用しているのか。 PCR温度設定を書き出して下さい。 何bpの産物を得ようとしているのか。 プライマーのTm値、長さ何mer

(無題) 削除/引用 No.4918-8 - 2016/03/22 (火) 23:51:36 - HA Tomonkyさん ご回答いただきありがとうございました。 あれからDNAを希釈して試したりもしたのですが、一向に改善せず悩んでおりました。 DNAの抽出はKAPA　Mouse genotype kitをLab全体で用いております。 同じDNAで他のPCRはかかるので、DNAの抽出に問題はないと思います。 ヒートブロックの温度に関してご教授いただきありがとうございます。 計測してみます。

(無題) 削除/引用 No.4918-7 - 2016/03/22 (火) 20:15:51 - Tomonky Genotypingがかからなくなることは私もよく経験したことがあります。 その際は全ての試薬を交換しても改善しませんでした（汗 質問者様はどのような方法でDNA抽出を行っていますでしょうか。 私の場合，50mM NaOHaq 500uLにて95℃で30分処理したサンプルに，pH7.4の1M Tris-HCl Bufferを加えてDNAの抽出を行っておりました。バンドが確認できなくなることが数回続いたため，同様のサンプルでより精度の高いCrimson Taqを用いて40サイクルPCRを行ったところ，バンドを確認することが出来ました。 そこで，目的配列の濃度が何らかの原因で少なくなっているのではないかと考え，ヒートブロックの温度を温度計で実測したところ，ヒートブロックの故障で100℃以上を表示しておりました。後で調べたところ，120℃以上の温度でDNA断片化を行うと，断片が短くなりすぎてしまい，PCRがかからなくなることがあるそうです。ヒートブロックの温度は表示温度よりも実測温度が高かったり低かったりするため，質問者様も実測してみては如何でしょうか。実測値が95℃であれば問題なくPCRがかかるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4918-6 - 2016/03/15 (火) 23:53:43 - おお 10ngならさほど多いとは思えないですね、、、

(無題) 削除/引用 No.4918-5 - 2016/03/15 (火) 18:13:28 - HA おおさん ご回答いただきありがとうございました。 至適条件が狭いプライマーセットではよくあることなんですね。 プライマーセットは、現在扱っているマウスを作った論文と同じものを使っています。 ポジコンは、マウスを作成したグループから頂いたDNAを使っています。 �@約１０ngのDNAを毎回使っておりますが、DNAを入れすぎの場合があるとのことですので、希釈して試みます。 タッチダウンPCRに関してお教えいただきありがとうございました。 �A研究室にあるPCRマシンで設定してみて試みます。 この度は丁寧なご回答いただきありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4918-4 - 2016/03/15 (火) 10:19:42 - おお よくあるのはゲノムのDNAを入れすぎている場合です。プライマーセットによっては意外とそれだけでかからなくなってしまうことが結構あります。ポジコンって何を使ったんですか？ でそういう気難しいプライマーセットとかで無難に増やす方法としてはタッチダウンなどがあります。タッチダウンはご自身でお調べになってみてください。

(無題) 削除/引用 No.4918-3 - 2016/03/15 (火) 07:20:52 - おお 低い->せまい

(無題) 削除/引用 No.4918-2 - 2016/03/15 (火) 07:17:48 - おお 至適条件のウインドウが低いプライマーセットではよくあることです。

ジェノタイピングPCRがかからなくなってしまいました。 削除/引用 No.4918-1 - 2016/03/14 (月) 23:44:27 - HA 以前までかかっていたマウスジェノタイピングPCRが突然全くかからなくなってしまい大変困っています。 対策として、すべてのPCR試薬を新しいものに変えて試みてもポジコンも含め失敗してしまいます。 以前まで出来ていたので、PCRのサイクルやプライマーのデザインに問題はないと思います。 PCRマシンが壊れたのかと思い、別のマシンでも試みましたができませんでしたし、別のPCRは適切なPCR　Bandが出ます。 同じDNAサンプルで別のプライマーでのPCRを行うと、適切なPCR bandが出てくるので、DNAに問題はないと思います　（念のため新たに抽出したDNAにて目的のプライマーでも試みましたができませんでした）。 その為、プライマーが劣化したと思い、目的のPCRプライマーを2社別のところから新たに購入してもできなくなってしまいました。 新たにDMSOを加えたり、グラジエントPCRにて違う温度にて試してみましたが一向にできません。 原因もわからず大変困っております。 どなたか、改善できるようなお知恵を拝借できませんでしょうか。 どうぞよろしくお願いいたします。

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