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Hisタグ抗体 トピック削除
No.4923-TOPIC - 2016/03/17 (木) 11:29:28 - c
6x His抗体は市販でも全然いいものがないと言われていますが、もし実際に使用してみての「これは良かった」「悪かった」等の意見をお持ちの方がいらっしゃいましたら情報いただけるとありがたいです。

割と発現量の低いと思われるHisタグ付きのペプチドを、WesternというかDot blotで検出しようと思ってるんですが（ヒト細胞だったり、Reticulocyte Lysateでin vitro翻訳したものだったり）、どうにもバックが高く発現無しサンプルでもシグナルが当たってしまう、ということに悩まされているので、なるべく特異性が高いものが望ましい状況です。
（そもそもどんなに特異性が高くても、トータルライセートは6xHisが当たるものなのかもしれませんが…）
ちなみに現在使っているのは、探してみて最安値だったGenscriptのpAbです。でも一応この会社の名誉のために言っておくと、バックが高いということは、感度はいい抗体と言えるのかもしれないですね。

過去トピックでもいくつか情報ありましたが、数年前のものなので新たな情報はないかな、と投稿させていただきました。よろしくお願いいたします。
　
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Genscript and BioLegend anti-His-tag 削除/引用
No.4923-6 - 2016/04/19 (火) 14:41:42 - T
遅レスですが、
他の方が書かれているようにすくなくとも哺乳動物細胞にはHis-containing proteinがたくさんあるようなのでドットプロットでは信頼性に乏しいかもしれません。ただ、anti-His抗体の感度は本当にピンキリということと、抗体のバックはHis-proteinを認識しているというよりも疎水性とかの物性の理由によりくっついてしまう真のノンスぺがあり、この程度もクローンによりピンキリなので、一概にanti-Hisでの検出はダメというわけではありません。
感度だけの話をしますと、Genscriptのポリクロanti-His-tagを使っているとのことですが、この会社のmouseモノクロは"golden standard"とうたっているだけのものはあります。また、BioLegendのanti-His-tag clone J099B12も感度いいです。J099B12は最高感度と言っているGenscriptのものと同等以上という売り込み文句をつけていたこともありました。使用推奨濃度はWBで共に0.1-0.2 μg/mlでほかのものより低濃度です。

(無題) 削除/引用
No.4923-5 - 2016/03/19 (土) 13:04:53 - ホラッチョ○×
大腸菌と比べるとほ乳類の細胞にはHisがたくさん並んだ蛋白質はわりとあるので、今見ている結果は正しい姿なのでしかたないし、抗体に起因する問題でないのでどうすることもできない。コントロール（His-tagged protein発現させてない細胞のライゼート）と並行して電気泳動して、差し引きでみるしかないとおもう。でもある程度発現が強くないとシグナルはBGに隠れてしまい識別困難かもしれない。タグを変えるか、あるいはHIs-tagのとなりにもう一つ別のタグつけてタンデムタグで２段階精製して精製度を高めればある程度BGは除けるとおもう。

(無題) 削除/引用
No.4923-4 - 2016/03/18 (金) 08:39:19 - c
trackerさん、おおさん、ご回答ありがとうございます。

やはりどうあれサンプルによっては6xHisだとかなりの非特異的シグナルが出てきてしまうものなのかもしれないですね。
でも、trackerさんにご提示いただいたHRP conjugateのNi-NTAは面白そうな商品です。検討してみる価値がありそうですね。有益な情報大変ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.4923-3 - 2016/03/17 (木) 21:21:03 - tracker
やはり発現量の低いターゲットをHisで検出するのは厳しいですよね。
NiやCo beadsで濃縮すればまだマシになるかもしれませんが…
NiのHRP conjugatedというのを使ったことがありますが、特異性はそこそこ良いように思いましたが感度は抗体に劣るので発現量が低いものはキビシイかもしれませんね。
一応低バックグラウンドを売り文句にしていたと思うのでためしてみるのはいいかもしれません。
数社から類似品が出ています。

(無題) 削除/引用
No.4923-2 - 2016/03/17 (木) 11:48:12 - おお
特異性が高くても、Hisが並んだ蛋白が人などの細胞では結構な数あるんじゃないかと思うので、タグ特異的にはならないと思ってるのだけど、、、

強いて言うなら、C末、N末特異的なHisタグに対する抗体があったようなきがするので、そういうのだとマシかもしれません。

Hisタグ抗体 削除/引用
No.4923-1 - 2016/03/17 (木) 11:29:28 - c
6x His抗体は市販でも全然いいものがないと言われていますが、もし実際に使用してみての「これは良かった」「悪かった」等の意見をお持ちの方がいらっしゃいましたら情報いただけるとありがたいです。

割と発現量の低いと思われるHisタグ付きのペプチドを、WesternというかDot blotで検出しようと思ってるんですが（ヒト細胞だったり、Reticulocyte Lysateでin vitro翻訳したものだったり）、どうにもバックが高く発現無しサンプルでもシグナルが当たってしまう、ということに悩まされているので、なるべく特異性が高いものが望ましい状況です。
（そもそもどんなに特異性が高くても、トータルライセートは6xHisが当たるものなのかもしれませんが…）
ちなみに現在使っているのは、探してみて最安値だったGenscriptのpAbです。でも一応この会社の名誉のために言っておくと、バックが高いということは、感度はいい抗体と言えるのかもしれないですね。

過去トピックでもいくつか情報ありましたが、数年前のものなので新たな情報はないかな、と投稿させていただきました。よろしくお願いいたします。
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