BioTechnicalフォーラム [リアルタイムPCRの融解曲線と電気泳動]

リアルタイムPCRの融解曲線と電気泳動

No.4927-TOPIC - 2016/03/17 (木) 18:50:56 - GE

リアルタイムPCRを行っておりますが、今回行ったリアルタイムPCRでは、融解曲線をみたところ、近接する位置にピークが2本見られました。

非特異的な増幅があると思い、リアルタイムPCRしたサンプルを電気泳動したのですが、きれいなシングルバンドで、プライマーダイマーらしきものも見られませんでした。また、PCRプロダクトをシーケンスしましたが、目的産物のみという結果です。

このようなケースは初めてなのですが、原因として何か考えられることがありますでしょうか？
　

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No.4927-8 - 2016/03/22 (火) 19:53:47 - GE

ジャスミンティーさま
ご返答ありがとうございます。今回のようなケースは初めてでしたが、アドバイスをいただき納得いたしました。

勉強になりました。皆様ありがとうございました。

(無題)

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No.4927-7 - 2016/03/22 (火) 12:06:00 - ジャスミンティー

GEさま

＞＞まさにそのような状態になっています。配列もよく見てみるとGC含量が偏っている領域もありました。
＞＞この場合、GC含量の偏りなどで、一種類のPCR産物でも解離するタイミングがずれてくるということでしょうか。

そうですね。今回のGEさまの場合、泳動とシーケンスの結果がありますので単一産物として結論づけてよいと思われます。

余談ですがちょっと調べてみたところ、1つの山に肩がついている場合に限らず、2つの山（ただし完全に離れているわけではなく接近して融合している感じ？）の場合も単一産物の時があるようですね。

(無題)

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No.4927-6 - 2016/03/18 (金) 17:19:19 - GE

ジャスミンティーさま
ふみさま
ありがとうございます。

＞＞それとも1つの山に肩がついているのでしょうか？

はい。まさにそのような状態になっています。配列もよく見てみるとGC含量が偏っている領域もありました。
この場合、GC含量の偏りなどで、一種類のPCR産物でも解離するタイミングがずれてくるということでしょうか。

(無題)

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No.4927-5 - 2016/03/18 (金) 09:14:51 - ふみ

PCR産物に、繰り返し配列(nnnATGCnnnATGCnnn)があったり、折り返し配列(nnnATGCnnnGCATnnn)があったりすると、ごく普通の2重らせんでない構造も取る可能性があるようです。後者の場合は、通常の2重らせん構造を形成するものに加えて十字構造を形成するものができる可能性があります。
融解曲線分析のアニーリングの際の温度変化を緩やかにするなどのことをすると、幾つかの構造を取り得る場合には再安定の構造を取るDNAの割合が増えるかもしれないと思いました。
(まゆにつばをつけて読んで下さい。)

(無題)

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No.4927-4 - 2016/03/18 (金) 09:05:57 - ジャスミンティー

2本というのは、2つの山があるのでしょうか？それとも1つの山に肩がついているのでしょうか？
後者であれば、単一産物でも配列中のATとGCの偏りで起こりえます。

(無題)

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No.4927-3 - 2016/03/18 (金) 08:41:39 - GE

おおさま
ありがとうございます。リアルタイムPCR後のPCR産物を精製し、リアルタイムPCRで使用したフォワード・リバースの両方のプライマーでダイレクトシーケンスしました。ですので、どちらかのプライマーだけで増えた場合の産物があったとしても、確認できるかと思っています。

(無題)

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No.4927-2 - 2016/03/17 (木) 22:48:24 - おお

シーケンスをどのようにしたのかわかりませんが、使ったプライマーから読めるPCRフラグメントが増幅された２種類のうち一方だけということはないですか？