おおさん、ありがとうございます。
そうなんですよね、６xでも十分濃いんですよね。
タンパク質の溶液濃度は5mg/mlほどで十分濃いんです。
ただ、どうしても100マイクログラムほどを乗せたいんです。
今回133マイクログラム乗せてみましたが、上手くいくかどうか。。
133マイクログラムを乗せるために40マイクロリットルをアプライしました。
中々検出が難しいと予想されるタンパク質でして、おおさんの仰るように多過ぎても分解能に大きく影響してしまうことは私自身の経験からも容易に想像はできるのですが、それでも多めに乗せてみたいんです。それは参考文献が Brain extracts (600 μg protein) of 8-week-old mice...云々書かれてあるんです。私のサンプルは脳ではなく、セルラインのライセートですが、20−60マイクログラムを乗せて行ったら僅かながら特異的な染色がバンドが、先の論文の同じ抗体で検出できたんです。ただロード量が少ないからなのか、それでも600マイクログラムをSDSページというのは信じられませんが、何かそれだけ乗せるための理由があると思うんです。
＞６xぐらいになるとー２０度で保存しているときにSDSが沈殿したりしてるんじゃないかな。
６xのラエムリサンプルバッファーは室温で保存しています。今まで何年もこの方法でウエスタンを行ってきており、問題は無さそうです。カレントプロトコルには−20℃保存と書かれてありましたが。DDTとダイは直前に入れています。 |
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