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(無題) 削除/引用 No.50-22 - 2012/01/23 (月) 21:34:23 - FACS 回答が遅くなってしまいすみません。たくさんのご意見ありがとうございます。 フローサイトメーターの経路を確認してみたところ、みなさんがご指摘の通り、蛍光の検出器では散乱光は検出しないようになっていました。 ですので、細胞のみで流した場合は自家蛍光を拾っているんですね。 知りませんでした。教えていただいてありがとうございます。 また、みなさんから頂いた意見を参考に、もう一度解析を行ったところ、細胞率だけ出すと有意差が見られるのですが、ヒストグラムを重ね合わせると見た人すべてを納得させられるようなデータではありませんでした。 有意差があることは間違いないのですが、客観的に見ると有意差がないと思われてもおかしくないデータだったので、条件を変えてもう一度データを取り直すことにしました。 条件を変えれば、MFIでも差が出るようになったので、こちらのデータを出したいと思います。 論文提出前に、いろいろな意見を頂くことが出来、大変参考になりました。 この問題は、解決済みとさせていただきます。みなさんありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.50-20 - 2012/01/23 (月) 11:04:40 - お粗末君 ＞同一の蛍光剤での、細胞間の結合性の違いは定量化できないかと思います。 例えば、顕微鏡であれば、細胞によってたくさん結合しているものとそうでないものの区別がある程度つけられると思います。（同じ条件で観察していれば） しかし、フローサイトメーターでは、このような区別がつけられないはずです。あくまで、全体としてどういう傾向にあるのかしか分からないと思います。 Rさんと重複しますが、ヒストグラムは横軸に蛍光剤がどれだけ結合したか、縦軸にその細胞数を示すグラフであり、傾向を示すものではありません。 ＞顕微鏡であれば、散乱光は拾わないので、細胞個々の結合力の差が分かるのではないかと思います。 蛍光顕微鏡で明らかな差が認められているのでしょうか。 蛍光顕微鏡で差があるにもかかわらず、フローサイトメーターで検出できないのであれば、恐らく励起光と蛍光のフィルターの組み合わせ が間違ってる可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.50-19 - 2012/01/21 (土) 08:44:54 - ab > しかし、フローサイトメーターだと細胞の散乱光も検出器が拾ってしまうために……… > 顕微鏡であれば、散乱光は拾わないので……… 散乱光（FSCとかSSC）と蛍光が一緒になってるようですが、無処理の細胞等ネガティブコントロールでピークがでるのは、散乱光ではなく蛍光です（自家蛍光など）。フローサイトは散乱光も蛍光も検出できますが、蛍光の検出器では散乱光は検出しないはずです。 顕微鏡で見るときでも、目視では見えなくてもCCDカメラの露光時間を長くすれば細胞自体が持つ蛍光を観察できますよね？これがフローサイトでのネガティブコントロールと同じ蛍光の強さと考えてよいと思います。 フローサイトでは蛍光はログで横軸を取るので幅広い範囲を比較できますが、顕微鏡で目視で見るときはそんなに幅広い蛍光量を比較できないですよね。 > なので、MFIで評価すれば、平均になるのでより確実な評価になると思いますが、今回の場合、MFIで評価すると差が分かりにくかったため、細胞率で評価しようとしているわけです。 MFIで差がわかり難いということは、ピークのシフトが少ないということでしょうか。それとも、ブロードになってしまうのでしょうか。MFIで比較するにしろ陽性率で比較するにしろ、有意差があれば問題にならないと個人的には思いますが、MFIと陽性率の両方を示したほうがよりよいのでは、と感じます（個人的にはグラフにしても問題ないと思うのですけど）。

(無題) 削除/引用 No.50-18 - 2012/01/21 (土) 00:37:53 - R フローについて少しかじった程度なので間違っていたらすみません。 散乱光と蛍光はそんなに干渉するのですか？ 散乱光と蛍光をフローサイトメーターはそんなに区別できないのですか？ 量子ドットについては全く分からないのですが、量子ドットからの蛍光は散乱光と同じ？？ それとも蛍光は測定していなくて量子ドットの結合による散乱光の変化を見ているのでしょうか。 率で評価すること自体には問題を感じません。 ただ、10^1を境界とすることには違和感を感じます。 ＞しかし、フローサイトメーターだと細胞の散乱光も検出器が拾ってしまうために、元々1個しか付いていなかったのに蛍光剤を加えて110個付いたものと、元々100個付いていたものに蛍光剤を加えて110個付いたものの区別は出来ないのではないかと思っています。（間違っていたらすみません） この例だと散乱光は関係ないのでは。 単にその蛍光剤に特異性がなくて、その実験系には使えないと解釈しました。 ヒストグラムの重ね合わせを示すのが、面倒でも納得してもらえると思います。

(無題) 削除/引用 No.50-17 - 2012/01/20 (金) 21:07:56 - FACS ＞R様 恐らくなんですが、たぶん皆さんが考えていることと私が考えていることはあまり差がないのではないかと思います。 ただ、文字だけで説明するのは非常に説明しにくいです。 説明がうまくできずに混乱させてしまい申し訳ないです。 ヒストグラムで表示されるということは、その集団の中に元々100個付いているものもあれば元々1個しか付いていないものもあって、平均すると50個付いている集団ということになりますよね。この平均50個というのがこの細胞のMFIですよね。 ですので、MFIで評価するのであれば、純粋に平均蛍光強度の差で違いを区別すれば良いと思います。 しかし、フローサイトメーターだと細胞の散乱光も検出器が拾ってしまうために、元々1個しか付いていなかったのに蛍光剤を加えて110個付いたものと、元々100個付いていたものに蛍光剤を加えて110個付いたものの区別は出来ないのではないかと思っています。（間違っていたらすみません） 顕微鏡であれば、散乱光は拾わないので、細胞個々の結合力の差が分かるのではないかと思います。 もちろん、同じ細胞を同じ条件で培養していればレセプターの発現量は大きく変わらないと思います。 なので、MFIで評価すれば、平均になるのでより確実な評価になると思いますが、今回の場合、MFIで評価すると差が分かりにくかったため、細胞率で評価しようとしているわけです。 ＞CS様 CS様が仰っている通り、私は化学系です。 実験内容もお察しの通りです。 評価したいのは、細胞ではなく作ったモノの方なので、その蛍光剤を加えて、細胞への親和性が違えば作ったモノの有用性が示せるというように考えています。 説明が遅くなってしまってすみません。察して頂いて、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.50-16 - 2012/01/20 (金) 16:23:35 - CS トピ主さんへの、ヒントとしては、 ＭＦＩが何の略なのか（特にＭ）を考えてみましょう。 なんとなくですが、 細胞生物系の分野では、 蛍光標識されたもの（抗体なり）を使って、細胞を評価しているのですが、 トピ主さんは化学系の分野の方で、 反対に、細胞を使って、新規の化合物＋蛍光色素の特異性などを 評価しているのではないかと思うのですが、 読み違いでしょうかね・・・。

(無題) 削除/引用 No.50-15 - 2012/01/20 (金) 14:20:22 - R ＞10個付いていても1000個付いていても、顕微鏡で観察しているわけではないので、どれが10個付いていて1000個付いているのか確認しようがないというのが私の考えです。 ＞例えば、顕微鏡であれば、細胞によってたくさん結合しているものとそうでないものの区別がある程度つけられると思います。（同じ条件で観察していれば） しかし、フローサイトメーターでは、このような区別がつけられないはずです。 フローだとその区別がつけられるようになるのでは。 フローサイトメーターは、細胞1個1個を解析した結果を 集団全体についてヒストグラムで表示しているのでは。 ソーティング機能がつけば、特定の細胞(集団)を分取できますよ。 ＞例えば、もともと1個しか付いていなかったものと100個付いていたものがあったとして、1個しか付いていなかったものに、蛍光剤を加えて110個ついたものと、100個付いてたものに蛍光剤を加えて110個になったものの区別 その蛍光剤というのは特異性がないということなのでしょうか。 蛍光標識抗体などでのフローでは、蛍光強度と抗原の発現レベルは比例していると思いますが。 何が目的の実験なのかあまり想像がつきません。 フローの原理を理解しているようないないような。 お粗末君様に同意します。

(無題) 削除/引用 No.50-14 - 2012/01/20 (金) 12:58:02 - FACS ＞お粗末君様 蛍光物質には量子ドットを用いています。これに複数種類の表面修飾を行い蛍光剤として用いています。 蛍光剤を変えたときの定量性は、フローサイトメーターの方が高いと思います。 しかし、同一の蛍光剤での、細胞間の結合性の違いは定量化できないかと思います。 例えば、顕微鏡であれば、細胞によってたくさん結合しているものとそうでないものの区別がある程度つけられると思います。（同じ条件で観察していれば） しかし、フローサイトメーターでは、このような区別がつけられないはずです。あくまで、全体としてどういう傾向にあるのかしか分からないと思います。 ですので、蛍光剤が変われば、結合性の違いを定量化できると思いますが、同一の蛍光剤で結合性の違いを区別するのはフローサイトメーターでは出来ないと考えています。

(無題) 削除/引用 No.50-13 - 2012/01/20 (金) 09:54:54 - お粗末君 >例えば、もともと1個しか付いていなかったものと100個付いていたものがあったとして、1個しか付いていなかったものに、蛍光剤を加えて110個ついたものと、100個付いてたものに蛍光剤を加えて110個になったもの のくだりが良く理解できません。通常のフローサイトメーターの使い方とは異なるようなので、具体的な蛍光物質など明らかにしていただかないと答えられません。 また、フローサイトメーターの方が顕微鏡よりも圧倒的に定量性があります。 ただ言えるのは、コントロールをもって境界を設定し、ポピュレーションの割合をグラフ化しても何の問題もありません。しかし、通常ヒストグラムは必要です。

(無題) 削除/引用 No.50-12 - 2012/01/19 (木) 22:23:47 - FACS ＞Harmonia様 フローサイトメトリーは相対評価なので、そのような絶対評価ができないと考えています。 結合したかしていないか、それだけしか分からないと思います。 10個付いていても1000個付いていても、顕微鏡で観察しているわけではないので、どれが10個付いていて1000個付いているのか確認しようがないというのが私の考えです。 例えば、もともと1個しか付いていなかったものと100個付いていたものがあったとして、1個しか付いていなかったものに、蛍光剤を加えて110個ついたものと、100個付いてたものに蛍光剤を加えて110個になったものの区別は、フローサイトメトリーでは出来ないと思います。 ですので、結合するかしないかだけしか判断できないと考えています。 適当な集団(細胞の大きさや内容物の多さなどを基準にして)を選んでいれば、同じ条件で培養した細胞の発現系が大きく異なるということはないはずです。 あったととしても、フローサイトメトリーでは数万個の細胞をカウントするので、全体の中の極僅かなものなのではないかと思います。 この考え方が正しくないのであれば、教えていただきたいです。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.50-11 - 2012/01/19 (木) 20:59:03 - Harmonia もう一回だけ質問しますね。 「あなたが見たいことは、電球110個と10000個を同じとみなして、ナゼ差し支えないのでしょうか？」

(無題) 削除/引用 No.50-10 - 2012/01/19 (木) 10:23:42 - FACS ＞Harmonia様、CS様 回答の内容が同じになってしまいますので、一緒に回答させていただきます。 ネガティブコントロールの設定方法については、使用している機器の違いだと思います。 というのは、私が利用しているBeckman CoulterのFC500では、蛍光強度1の位置がヒストグラムの左端ではないからです。 左端は限りなく0に近い数字になっており、感度調節を行っても変わらないようになっています。 ですので、蛍光強度を1にしていても、細胞の散乱光を拾ったピークが見えてきます。 むしろFC500のヒストグラムが特別というか、マイナーな設定になっているのですね。初めて知りました。 　　　 評価の方法についてですが、私が考えている評価方法では、電球が110個光っていても10000個光っていても、同じとみなしています。 110個以上光った細胞を、蛍光剤が結合した1個の細胞というようにしています。 ですので、同じ条件で培養した細胞を3回フローサイトメトリーにかけて、再現性をとり、標準偏差を出しています。 今回の結果の場合、細胞の大きさがある程度一定になるように、ゲートをかけており、極端に結合する数が変わるということはないものと考えています。

(無題) 削除/引用 No.50-9 - 2012/01/19 (木) 09:16:53 - CS グーグルの画像検索のイメージが参考になるでしょうか。 http://goo.gl/4yaGb Harmoniaさんも >・何も蛍光剤を入れない場合。電球が無いけど、反射で光って見える場合です。 と仰っているように、 普通の無染色の細胞でもFACSでは「ピーク」を見ることができます。 通常、これをネガティブコントロールとして、 この蛍光強度より大きいものを陽性として設定しますよね。 もし蛍光強度が１（すなわちグラフの左端）に境界を設定したとすると、 ヒストグラム上には、なにも表示されないことから 感度の設定など、正しいかどうか判断できないからです。 （恣意的に感度を落としたとしても分からない・・・。） ですので、１０〜２０くらいに境界を設定し 無染色の細胞でも、１〜１０のところにピークが現れるようにすると、 FACSの感度の設定は、大丈夫ですよと言うことができます。

(無題) 削除/引用 No.50-7 - 2012/01/19 (木) 08:33:00 - Harmonia もしNo.50-2 への回答がNo.50-4であるなら、不十分です。 どのように妥当かが示されていません。 ぼくが思い浮かべるフローサイトメーターのイメージはこうです。 蛍光剤が細胞に１分子くっついた場合、電球が１個灯ったと表現しておきます。 コントロールは何種類か想定できますが、まずは ・何も蛍光剤を入れない場合。電球が無いけど、反射で光って見える場合です。 ・蛍光剤が何かの物質を選択的に認識してくっつく場合。その物質が無いはずでも、間違って電球が灯っている感じです。 少なくともこのようなコントロールが考えられます。 次に評価です。 コントロールで100個の電球が灯ったとします。 実験区では、灯った電球の数からコントロールの100個分を（引き算か割り算かは別として)さっぴくのですよね？ 実験区では電球の灯り方が110個のも有れば10000個のも有ったとします。 ここで質問。 「あなたが見たいことは、電球110個と10000個を同じとみなして差し支えないでしょうか？」

(無題) 削除/引用 No.50-6 - 2012/01/19 (木) 01:49:23 - FACS ＞CS様 サプリメントデータにすればいいんですね。 確かに、そのようにすればTableで表せそうですね。 大変参考になりました。ありがとうございます。 > 蛍光剤を何も加えてない細胞をコントロールとした場合、普通、軸をLog10でとったら、蛍光強度が「１０」〜「２０」あたりに、ポジネガの境界がくるよう、設定すると思いますが。 とありますが、蛍光強度を10〜20あたりにする必要があるのはなぜか教えていただけないでしょうか？ 私の研究室では、今の方法が主流になっているので…。

(無題) 削除/引用 No.50-5 - 2012/01/19 (木) 01:21:41 - CS この場合、すべてのヒストグラムが要求されると思います。 サプリメントデータにすればいいことですし。 オーバーレイで表示してもいいでしょうし。 そのうえで、本文中では、陽性細胞率をTableで表すという方法もとれると思います。 あと気になったのは、 蛍光剤を何も加えてない細胞をコントロールとした場合、 普通、軸をLog10でとったら、 蛍光強度が「１０」〜「２０」あたりに、ポジネガの境界がくるよう、設定すると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.50-4 - 2012/01/19 (木) 00:55:50 - FACS ご意見ありがとうございます。 ＞Harmonia様 蛍光剤を何も加えてない細胞をコントロールとし、蛍光強度が1(10の0乗)以下になるように設定します。(1以上の細胞の割合が0％付近になるように設定しています) そして、蛍光剤を加えた細胞の何％が蛍光強度１を超えたかを棒グラフ化して、相対的に評価しようと考えています。 細胞の種類が増えても、それぞれの細胞ごとにコントロールの細胞があるので、あくまで細胞間での相対評価になりますが、評価方法としては妥当だと考えています。 もちろんそのままヒストグラムを出しても差が分かるのですが、加える蛍光剤の種類が多いことと細胞の種類が多いため、すべてのヒストグラムを出すと逆に分かりにくくなるのではないかと感じたため、このような評価方法を検討しています。 ただ、論文などでフローサイトメトリーの結果を棒グラフ化したデータをあまり見たことがないので、少し自信がなくてお聞きした次第です。 ＞CS様 Harmonia様への回答ですでに述べさせていただきましたが、細胞の種類と培養条件、使用した蛍光剤が多いため、すべてのヒストグラムを掲載すると逆に分かりにくくなってしまうのではないかと考えて、結果を棒グラフかしようと考えました。 ヒストグラムを全く載せないと説明が出来ないので、どれか1種類だけヒストグラムのデータを載せようかと考えています。 CS様がおっしゃる通り、解析の仕方によっては、細胞率での評価方法を見たことがありますし（棒グラフ化したデータはまだ見たことがありませんが…)、そういう評価ができないわけではなさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.50-3 - 2012/01/18 (水) 20:19:24 - CS >フローサイトメトリーの結果をグラフ化 との「グラフ化」とは何を意味しているのでしょうか？ 「数値化して棒グラフなどにする」という意味でしょうか？ 普通、FACSの結果は、 まず、そのままのグラフ（ヒストグラムや２次元プロット）を論文中には載せますよね？ その上で、数値化することになると思いますが、 MFIで表すか、細胞率で表すかは、個々の実験の内容によると思います。 ちなみに、私が行っている研究分野では、 細胞率で表すのが一般的な分野ですね・・・。

(無題) 削除/引用 No.50-2 - 2012/01/18 (水) 19:46:44 - Harmonia 「不可能」の意味は、そういうデータ処理をしようとすると、コンピュータが停止するとか？ そんなことは無いと思うので、「可能」です。 ただし、「妥当」かどうか、知りません。 そういうデータ処理をすることで、 ・あなたが見たいことを見ている ・見なくていい側面を間違って見てしまうことはない ということを論理的に説明できれば、「妥当」です。 論文で見かけるいかなる手法も、論理的に説明ができて、コミュニティーのメンバーが妥当だと納得したからそうなっているのです。 あなたが考えたその評価方法が、どのように「妥当｣か、書いてください。

フローサイトメトリーの評価方法について 削除/引用 No.50-1 - 2012/01/18 (水) 11:43:37 - FACS いつもお世話になっております。 フローサイトメトリーの評価方法について教えていただきたいことがあります。 フローサイトメトリーの結果をグラフ化したい時には、細胞一個当たりの蛍光強度であるMFIで評価するのが一般的かと思いますが、例えば、蛍光強度が1(10の０乗)を超えた細胞の割合(%)で評価することは可能でしょうか？ MFIで差が出ていないことはないのですが、割合の差で評価すると差が大きくなります。 細胞は4種類用いていて、加えた蛍光剤(修飾されているものが異なります)や培養の条件はすべて同じになっています。 論文ではこのような評価方法を見たことがないので、ご意見をお聞かせください。

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