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アルカリプレップでプラスミドが取れない トピック削除
No.500-TOPIC - 2012/05/09 (水) 21:09:44 - 実験初心者
こんにちは、今年から研究室に配属された大学4年の者です。
pBluescriptをバックボーンとしたプラスミドを含む大腸菌を、
50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で14時間培養した後、ミニプレップを行いました。
作業は、
LB培地を遠心　→　ペレットにSol１を加えて懸濁
→　sol2及びsol3を加え、遠心
→　フェノール抽出　→　100％エタノールでエタ沈
→　75％エタノールでリンス
という流れです。
ここで、100％エタノールでの遠心の時点で、DNAペレットが見えなかったのですが、最初にとる大腸菌の量を半分にして同じミニプレップを行ったところ、ペレットが現れました。
大腸菌が作業しているtubeの中で多すぎると、ミニプレップに影響する可能性はあるでしょうか？

よろしくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.500-6 - 2012/05/22 (火) 13:18:39 - 挽きたて
RNaseA処理しても得られる沈澱はほとんどRNAですから誤解しないように。plasmidは数％以下。なお、RNaseA処理−＞PEG/NaCl沈澱すればRNAはかなり減らせます。

まずは 削除/引用
No.500-5 - 2012/05/22 (火) 10:48:28 - pure
もっと操作の過程について考えましょう。
sol1〜3の役割, 遠心する理由, フェノクロする理由…
などなど, それぞれの過程について調べてみてください。
簡単な操作でも理解して実験する事で, 楽しさも格段に上がりますよ。

アドバイスありがとうございます。 削除/引用
No.500-4 - 2012/05/10 (木) 12:57:00 - 実験初心者
的確なご助言をありがとうございます。
確かに、自分の操作を見てもらい易い研究室の人にまず相談するべきだったと思います。

えっとさんの仰る操作や現象は全て確認しています。
ミニプレップに用いた大腸菌入り培地の量は1.5ml、
sol1、2、3はそれぞれ100μl、200μl、150μlです。
大腸菌入り培地を半分の750μlに減らしたところ、エタ沈DNAが現れました。

qqさんの仰ることについては、
sol2を加えたところ溶液が透明になり、Sol3を加えると白い沈殿物が
現れました。

(無題) 削除/引用
No.500-3 - 2012/05/10 (木) 09:02:24 - えっと
４月５月になると、この手の質問が増えるのだが・・・

まずは、ここで聞くよりも、ラボの先生や先輩に聞きましょう。
人間関係の構築と言うのは、何よりも大事なことです。

また、百聞は一見に如かず、というように、
実際の操作を見ながらのほうが、
質問するにも、教えるにも、
一番物事を正確に伝えることができます。


まあ、小言ばかりもなんなので。
・ミニプレップに使った、大腸菌のＬＢ培養液の液量は？
・Ｓｏｌ１，２，３の各液量は？
・Ｓｏｌ１を加えた後、しっかりと大腸菌を懸濁していますか？

・Ｓｏｌ２を加えた後、５〜６回の穏やかな転倒混和で、
　全体が均一になるよう混和していますかますか？

・Ｓｏｌ３を加えた後、５〜６回の穏やかな転倒混和で、
　全体が均一になるよう混和していますかますか？
　（このステップで白い不溶解物が生じるはずです。）

大腸菌の量に対して、十分に溶解するだけのＳｏｌ１の量が無いといけません。
Ｓｏｌ１の量に応じて、Ｓｏｌ２、Ｓｏｌ３の量も、おのずと決まってきます。

(無題) 削除/引用
No.500-2 - 2012/05/09 (水) 21:57:44 - qq
>→　sol2及びsol3を加え、遠心
のところで、大腸菌が最低目視で完全に溶解していることが、必須だと思っています。

アルカリプレップでプラスミドが取れない 削除/引用
No.500-1 - 2012/05/09 (水) 21:09:44 - 実験初心者
こんにちは、今年から研究室に配属された大学4年の者です。
pBluescriptをバックボーンとしたプラスミドを含む大腸菌を、
50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で14時間培養した後、ミニプレップを行いました。
作業は、
LB培地を遠心　→　ペレットにSol１を加えて懸濁
→　sol2及びsol3を加え、遠心
→　フェノール抽出　→　100％エタノールでエタ沈
→　75％エタノールでリンス
という流れです。
ここで、100％エタノールでの遠心の時点で、DNAペレットが見えなかったのですが、最初にとる大腸菌の量を半分にして同じミニプレップを行ったところ、ペレットが現れました。
大腸菌が作業しているtubeの中で多すぎると、ミニプレップに影響する可能性はあるでしょうか？

よろしくお願い致します。
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