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(無題) 削除/引用 No.5012-5 - 2016/04/29 (金) 00:39:24 - 低分子ウェスタン乙 低分子量用の膜やTris　Tricine　gelはもちろんだけど、2~3KDaだと転写以前に分離したペプチドのゲル内での拡散防止や保持の問題も考えないといけないかもしれない。ゲルの平衡化でもロスが無視出来ないかもしれない。 たぶんもう終わった技術なのかもしれないけど昔クリーブランド法っていうやつやってペプチド断片のN末シーケンスしたんだが、低分子用のPVDFでも6KDa 位までならわりといけるけど、それ以下になるとなんか急激に回収率悪くなる印象があったけど。膜の保持能としてどこまでの分子量を保証してるかメーカーにきいてみたらどうかな。相当量の基礎検討データを持ってると思うし。

(無題) 削除/引用 No.5012-4 - 2016/04/24 (日) 08:36:23 - おお http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2447166/

(無題) 削除/引用 No.5012-3 - 2016/04/24 (日) 07:06:51 - pvdf 素早い回答ありがとうございます。なるほど、見たいペプチドが偶然ニトロセルロースとの親和性が高い（というかPVDFとの親和性が著しく低い）という可能性はあり得ますね。非常に小さいペプチドなので、配列特有の物性に大きく左右され得るのは納得のいくお話です。 0.1 umもチャレンジしてみる価値がありそうですね。0.2と大して違わないんじゃないだろうかと思ったのと、それからトランスファーの条件を上手く振ることで重ね置きした2枚目にはほぼ全く透過したペプチドが検出されなかったことから試していなかったんですが、やってみようと思います。 固定についてもどんな感じで行えばいいのか調べてみようと思います。 非常に有用なアドバイスどうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5012-2 - 2016/04/24 (日) 06:09:18 - おお >実は低分子の捕捉に関してはPVDFよりニトロセルロースの方がうわて 一般論では逆ですが、ここのペプチドで見た場合、ニトロセルロースの方がいいということはありえるとおもいます。また、吸着の仕方によって抗体認識部位が露出しにくかったりとか言うので感度が変わったりという可能性もあるんじゃないかと。 ニトロセルロースで高吸着ように0.1umの膜が売っています。 ある論文で、トランスファー後にフォルムアルデヒドで固定しているものを見たことがあります。

低分子検出時のニトロセルロースとPVDF 削除/引用 No.5012-1 - 2016/04/24 (日) 05:36:23 - pvdf 極小のペプチド（2-3 kDaとかそこら）をなんとかWesternで検出できないかと苦戦しているのですが、Tris-TricineバッファーのPAGEとやや高めのメタノール濃度のトランスファーで、ニトロセルロース膜を用いて何とか検出できるまでに至りました。 しかし、共用のChemi-Lumi装置で検出していたら、近場のラボの人に「ニトロセルロース使ってるの？PVDFの方がいいでしょ」と言われ、言われてみればそうだなと思いPVDF (0.2 um)を用いて同じ条件で検出を試みました。 ところがPVDFでの検出結果は散々で、ニトロセルロースで巨大なシグナルが得られた量をアプライしても一切シグナルが得られませんでした。ラダーはしっかりと転写されているように見受けられるため、ブロッティング自体に問題はないと思うのですが、実は低分子の捕捉に関してはPVDFよりニトロセルロースの方がうわてだったりするのでしょうか？ またそれに限らず、膜の違いの他にも、低分子の検出に役立ちそうなTIPSをご存知の方がいらっしゃいましたらご教示いただけると幸いに思います。 よろしくお願いいたします。

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