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(無題) 削除/引用 No.5017-6 - 2016/04/26 (火) 12:26:35 - hep 肝臓の細胞全体か低速遠心で肝細胞を濃縮したものと比較しないと、PCRでもフローサイトでも何を見ているのかわからなくなります。 AFPをPCRでみてますが、胎児肝細胞かガン組織でなければ発現は見られないタンパク質です。 また、酵素の種類にもよりますが、酵素処理によってE-cadherinが分解される可能性は非常に高いのでフローサイトでの解析には適していません。また、肝細胞でもE-cadherinの発現にはゾネーションがあります。 細胞を固定してもよいのならalbumin、SERPINA1、HNF4Aなどでフローサイト解析はできるので一番楽なのですが、細胞表面タンパク質しか用いることができない理由はあるのでしょうか。 細胞表面タンパク質ではASGR1が肝細胞に特異的ですが、よい抗体が売られていないのが難点です。 あとは、薬物輸送トランスポーターが肝細胞に特異的なものがありますが、実際にやったことはないです。

(無題) 削除/引用 No.5017-5 - 2016/04/26 (火) 04:21:48 - CD ソート後の細胞の殆どがCD45陽性細胞であることが示されれば良いような気もしますが、いかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5017-4 - 2016/04/26 (火) 03:19:19 - NY おお様、早速書き込みいただき、感謝しております。 詳細な実験をいいますと、ある蛍光標識バクテリアをマウスの眼底静脈よりinfusionし、その後、肝臓のセクションを染めますと、albumin陽性の細胞ではそのバクテリアの蛍光は観察されず、バクテリアの蛍光は全てF4/80+のKuffpfer細胞と重なるconfocalでのhigh resolusional imagesのデータがあります。ですが、それでは膜表面にいるのか、ingestedされたものなのかが判定できないので、flowでさらに補強しようとしています。 percollでのKupffer cellsの分離は完璧ではなく、hepatocytesのコンタミは必ずあります。enrichするだけであり、isolationとは言えないレベルです。 フローにより、F4/80+の細胞でbacteriaの蛍光は見えますが、F4/80 negativeの細胞でbacteriaの蛍光が見えるかどうかが今のfocusになります。免疫組織染色から、その可能性は低いと考えていますが、なにぶん先行研究がhepatocytesがprimaryなphagocytesとして機能することがすでに報告されており、それをリバットする論文になるためきちんとした論拠および根拠が必要なんです。 おおさまのご指摘にようにhepatocytesでのqPCRも考えが及ばず恐縮しておりますが、ぜひ行ってみたいと思います。 hepatocytesのマーカーと、bacteriaのGFPをフローで見られたら一番嬉しいのですが、意外にもhepatocytesのフローの論文といいますか、establishされたマーカーというのが無いのかもしれないですね・・

(無題) 削除/引用 No.5017-3 - 2016/04/26 (火) 02:10:48 - おお >hepatocyteとの比較 あるいは肝臓から直接RNA取ったものとの比較。肝細胞は培養でかなりアルブミン合成能が落ちるので、そういうのとの比較はちょっと厳しいでしょうけど。 Kuffper cellsポジティブを示すというのはお考えになったことがありますか？蛍光顕微鏡で何％がポジティブだったとか。

(無題) 削除/引用 No.5017-2 - 2016/04/26 (火) 02:04:51 - おお >これまでにhepatocyte-specificなalbuminやAFPのqRT-PCRを行いましたが、bandが出てしまい、 hepatocyteとの比較で何％以下とか見積もれないですか？

マウスHepatocyteマーカー（フローサイトメトリ） 削除/引用 No.5017-1 - 2016/04/26 (火) 01:00:02 - NY 質問させてください。 マウス肝臓を酵素処理し、Kuffper cells（F4/80+）をマグネティックビーズで回収し、様々な実験を行ってきましたが、回収したフラクションにHepatocytesがコンタミしていないかどうかをrevierから指摘されました。 これまでにhepatocyte-specificなalbuminやAFPのqRT-PCRを行いましたが、bandが出てしまい、おそらくPCRでは感度が高すぎてほんのすこしのコンタミでも陽性になってしまうのだと考えています。 hepatocyteのフローサイトを行い、そのコンタミがmajorityではないことを示したいのですが、マウスhepatocytesの表面マーカーで有用そうなものを調べても出てきません。 E-cadherinなどがありましたが、distinctに染まるパターンではありませんでした。 そこで皆様に肝臓のhepatocytes (実質細胞、parenchymal cells)を染められる抗体でいいものをご存知でしたらご教示いただけないでしょうか？ 大変稚拙な質問で恐縮していますが、どうかよろしくお願い致します。 同時並行でAlbumin-Creマウスとレポーターマウスの掛け合わせ実験も行ってはいますが、revise期限もあり、皆様に質問させていただきました。どうか、よろしくお願い致します。

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