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SyberGreen PCRと普通のPCR トピック削除
No.5058-TOPIC - 2016/05/12 (木) 10:56:26 - PCR初心者
おはようございます！！

PCRしてバンドを確認したいんですが、出て欲しい検体にバンドが出ません…
ECMで飛ばして得た組織由来のmRNAなんで極微量です。65サイクルは相当なもんだと思いますが。

HPRTは出てるのでちゃんと逆転者反応は起きてるはずなんですが。。。。。。コンタミの可能性はありますが。。。。。

定量PCR用のサイバーグリーン（バイオラッド）でPCRしてますが、やっぱり普通のPCR？（タックポリメーゼとか使ったりして）でやった方がいいですかね？

100サイクルでもバンドさえ出てくれればそれでこの実験は終わりになるのですが、サイバーグリーンの試薬では100サイクル持ちませんかね？何か工夫がありましたら教えてください！！
　
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(無題) 削除/引用
No.5058-5 - 2016/05/13 (金) 01:01:57 - しろ
>[Re:1] PCR初心者さんは書きました :
> おはようございます！！
>
> PCRしてバンドを確認したいんですが、出て欲しい検体にバンドが出ません…
> ECMで飛ばして得た組織由来のmRNAなんで極微量です。65サイクルは相当なもんだと思いますが。
>
> HPRTは出てるのでちゃんと逆転者反応は起きてるはずなんですが。。。。。。コンタミの可能性はありますが。。。。。
>

PCR自体はできている、ご自身の手技に特に大きな問題はない、と考えますと、出て欲しいターゲット用のプライマーに問題はないでしょうか？以前そのプライマーを別のサンプルに使用したときにバンドが出たものでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.5058-4 - 2016/05/12 (木) 14:54:18 - AP
>定量PCR用のサイバーグリーン（バイオラッド）でPCRしてますが、やっぱり普通のPCR？（タックポリメーゼとか使ったりして）でやった方がいいですかね？

リアルタイムPCRをやるんじゃなければ、それ用のSybrGreen入りの試薬はコスト的にもったいないんじゃないでしょうか。通常のPCR試薬、酵素でやったほうが堅牢で最適条件からの逸脱にも強いと思います（酵素にもよりますけれど、Taqは松竹梅の竹くらいかな）。

(無題) 削除/引用
No.5058-3 - 2016/05/12 (木) 12:41:54 - おお
バンドが出ればいいということですが、実験の目的がよくわならないのでなんとも言えませんが、１コピーもあれば４０サイクル回せばバンドがでるようになってます。

なので１００サイクルで出てもあなたは終りと思っているかもしれませんが、周りは受け入れてくれないでしょう。qPCR用の試薬を使っているということなのかと思いますが、qPCRは増幅効率にかなり神経を使う方法なのでかなりいい条件で回せるように工夫はされてると思います。

また極微量と言われても科学的な表現でないのであなたの実験にあったsuggestionができません。

(無題) 削除/引用
No.5058-2 - 2016/05/12 (木) 11:15:30 - AP
PCRは40サイクルが限度ということになっていなかったかな。酵素や反応系の安定性もそうだけど、一分子だけから初めてもそれぐらいで十分検出可能になるはずで、そうでないなら、そのままやっても無駄ということではないかな。

そういう時はnested PCRをするのが常法（知らなければ自分で勉強して）。nested primerが手元にないとしても、一旦、PCRをかけた(1st PCR)反応液からごく一部（1 uLとか）とって2nd PCRの鋳型とする、というだけでも徒にサイクル数を増やすよりよっぽどいい。

SyberGreen PCRと普通のPCR 削除/引用
No.5058-1 - 2016/05/12 (木) 10:56:26 - PCR初心者
おはようございます！！

PCRしてバンドを確認したいんですが、出て欲しい検体にバンドが出ません…
ECMで飛ばして得た組織由来のmRNAなんで極微量です。65サイクルは相当なもんだと思いますが。

HPRTは出てるのでちゃんと逆転者反応は起きてるはずなんですが。。。。。。コンタミの可能性はありますが。。。。。

定量PCR用のサイバーグリーン（バイオラッド）でPCRしてますが、やっぱり普通のPCR？（タックポリメーゼとか使ったりして）でやった方がいいですかね？

100サイクルでもバンドさえ出てくれればそれでこの実験は終わりになるのですが、サイバーグリーンの試薬では100サイクル持ちませんかね？何か工夫がありましたら教えてください！！
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