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(無題) 削除/引用 No.5077-9 - 2016/05/21 (土) 00:10:58 - おお >RIPAバッファーでタンパク質を抽出しても粘性はほとんどないので、 >遠心せず、そのまま泳動に使っても良いのですかね？ いや、そこは遠心すべきじゃないか。。。

(無題) 削除/引用 No.5077-8 - 2016/05/20 (金) 11:39:39 - さかなちゃん みなさん、ありがとうございました。 せっかくなので、遠心前のサンプルと、遠心後の上清、またシリンジを 使ったサンプルでをWBしてみて、バンドの濃さにどのような違いがあるか 比較してみようと思います。 貴重なアドバイスをありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5077-7 - 2016/05/20 (金) 00:49:23 - おお その状態でもかなり核の蛋白が抽出されています。またもう少しマイルドな方法を使うこともあります。核全体が可溶化してないのではなく、主に核マトリクスの一部とクロマチンの一部がペレットになっていると考えてください。

(無題) 削除/引用 No.5077-6 - 2016/05/19 (木) 23:57:41 - 独り言 ピペッティングでペレットをほぐしてから、26G以上のニードルとシリンジで１０−３０ぐらいネバネバの液を通せば、ゲノムが剪断されてネバネバが解消して、ゲルにアプライできるようになります。

(無題) 削除/引用 No.5077-5 - 2016/05/19 (木) 23:13:43 - さかなちゃん アドバイス、ありがとうございます。 そうです、遠心によるペレットは核に由来するものです。 RIPAバッファーでタンパク質を抽出しても粘性はほとんどないので、 遠心せず、そのまま泳動に使っても良いのですかね？ 今回目的としてるタンパク質は細胞質に局在してるので、ペレットを 破壊する必要はなさげですが、核タンパク質を扱う時はどうやって タンパク質抽出するか悩んでました。

(無題) 削除/引用 No.5077-4 - 2016/05/19 (木) 19:15:34 - おお ニードル２５Gぐらい グラスビーズ ポリトロン フレンチプレス（多分容量に無理があるけど） ホモゲナイザー http://www.n-genetics.com/product_detail.html?item_id=4524 ビートビーター もし、溶液がどろどろになってなければ、すでに指摘がありますように上記のものを使わず遠心してペレットをのぞいてもいい場合が多いです。ペレットの大部分はクロマチンとか核マトリクスかと思います。それに関する研究の場合はちょと注意が必要かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5077-3 - 2016/05/19 (木) 18:03:56 - 小言幸兵衛 多くのタンパク質はその条件で可溶化されているので、超音波破砕装置を用いる必要はありません。もちろん、この条件で可溶化されないタンパク質は沈殿に含まれていますが、その状況で破砕をしても、沈殿は細かくなっているだけで結局のところ可溶化はされないのではないでしょうか。 SDSで可溶化した場合に超音波を掛けるのは、ゲノムDNAのせいで粘稠になったサンプルを扱いやすくするのが目的です。

培養細胞のタンパク質抽出方法について 削除/引用 No.5077-1 - 2016/05/19 (木) 17:45:42 - さかなちゃん 培養細胞のタンパク質抽出方法について質問します。 学生のころは、培養細胞をSDSを含むBufferでサスペンドしたあと、 超音波破砕装置で細胞を破壊していました。 しかし、ラボが変わって、この破砕装置はありませんし、高額なので 購入がすぐにできません。 現在は培養細胞をRIPA Bufferでサスペンドしたあと、15000rpmで 遠心すると、RIPAで溶解できなかったものがペレットとして現れます。 超音波破砕装置があればこのペレットを完全にバラバラにできたのですが、 なにか破砕装置に代わってバラバラにできる方法ってなにかないでしょうか？ ホモジナイザー程度ではバラバラにできないと思います。 何か良いアイデアがあれば、教えてください。

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