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Y2Hに関して トピック削除
No.5081-TOPIC - 2016/05/20 (金) 11:38:16 - 舛添
舛添といいます。宜しくお願いします。

今みている現象に関して、どうにもAとBが直接結合はしていないようで、第三者のC(未同定)が介在している気がします。

AやBをbaitにY2Hをやるか、AかBでIPして質量分析など、、多くのCの同定方法があると思います。どれが正攻法でしょうか?Y2Hは中々チャレンジングだと思います。ですが、雰囲気としてそれで同定できたらかっこいいなと思います。

舛添
 
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No.5081-7 - 2016/05/22 (日) 21:07:21 - くぁswでrftgyふじこ
最近、いろいろたいへんですね。
まずCを同定したいですね。ただCがひとつとは限らないですね。
てかABCとも大きな複合体の一部かもしれないし。

取り敢えずIPでA,Bを含む複合体を精製して、co-IPされるものを同定して、候補分子のリコンビナント作って、in vitroで再構成実験したらどうでしょうか。
プロテオミクスは、もし培養細胞系ならSILACでやるのがいいかもしれない。

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No.5081-6 - 2016/05/21 (土) 14:25:28 - ポスポス
扱っているタンパクはヒト由来ですか?酵母由来ですか?

酵母由来なら,IP-MS/MSで複合体を同定し.同定したタンパクの遺伝子を欠失させた株でY2Hやれば面白いかなーって思いましたが・・・・.

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No.5081-5 - 2016/05/20 (金) 12:48:55 - おお
AとBのリコンビナントをつくって、Aをレジンにくっつけた状態で、それとは別にライセートからAかBでプルダウンしたフラクションを取ってきて、そのフラクションをさらに分画しながらAのついたレジンにBとともにくっつけて、Bがよく付くフラクションを見つけるとか。

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No.5081-4 - 2016/05/20 (金) 12:42:59 - おお
それぞれの方法でどれがかっこいいとかないと思いますね。。。よほど何か新規な方法とかでアプローチしたっているならまあある意味かっこいいかもしれんけど。

バクテリアで2ハイブリットっていうのも開発されているよ。

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No.5081-3 - 2016/05/20 (金) 12:15:50 - asan

この手の解析って、正攻法は合ってないような気もします。要するに、自分たちの得意分野でどれが一番早く確実に解析できるか、って所でしょうが、どんな方法でやっても上手く行かない事もあったりするでしょうから。直接結合でないことがほぼ確実に言えるならば(これも厳密には難しい)、古典的にはY2Hはよくやられてる気もします。ただ、擬陽性の問題やそもそもin vitroで1つの因子だけで結合してるのか分からんので何も取れてこないリスクもあったりするでしょう。MSに関しては、原理的に全結合分子を取ってくるのは困難だし、直接結合分子以外も沢山あったりするので結構”アテ”実験的な感じもあるでしょうが、身近に解析をしてるラボなら細かい事考えてないで取りあえずAとBの結合分子で共通なものとかのリストを出してしまったりするのは現実的だと思います。全くMSを使った事のないとか全部企業に受託のラボとかだと、サンプル調製からしてちょっと大雑把なやり方とも思いますが。

アウトプットの仕方を工夫する必要はあるでしょうが、今ならノックダウンやノックアウトで大規模にフェノタイプを評価することで間接的に必要分子から取ってくるなんて手法もあるかもしれない思ったり。いずれにせよ、カッコいいか格好わるいかはともかく、ラボでアプローチしやすい方法(得意か不得意か)とどういう分子を想定してるのか(in vitroで結合する特定の分子しか想定しなくてい良いのか)とかでしょう。個人的にはin vitroで特定の間接因子を同定することで論文の全体像に大きく関わってくるというならば、Y2Hはある程度すぐにやれそうならそれはやってもいいんじゃないですかねと思います。単に複合体の間接かどうかを評価するだけ…というならそこまでするメリットあるかな〜って感じでしょうか?

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No.5081-2 - 2016/05/20 (金) 12:02:51 - おお

質量分析はおそらくいろいろな蛋白を含んだコンプレックスが取れてくるので、複数の候補が上がる可能性が高いです。その中でどれが直接ついているのかとか検証していかないといけないかもしれません。

そういう意味ではY2Hのほうがどちらかと言えば直接的かなとおもいますが、運が良ければワークするだろうって言う感じかなぁと。IPー質量分析で候補を探って。Y3HやY2Hで探っていくのも手かもしれません。

Y3Hでスクリーニングするというのもありといえばありですね。ただ間に噛んでるのは1つだけかどうか。。。

Y2Hに関して 削除/引用
No.5081-1 - 2016/05/20 (金) 11:38:16 - 舛添
舛添といいます。宜しくお願いします。

今みている現象に関して、どうにもAとBが直接結合はしていないようで、第三者のC(未同定)が介在している気がします。

AやBをbaitにY2Hをやるか、AかBでIPして質量分析など、、多くのCの同定方法があると思います。どれが正攻法でしょうか?Y2Hは中々チャレンジングだと思います。ですが、雰囲気としてそれで同定できたらかっこいいなと思います。

舛添

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