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(無題) 削除/引用 No.51-14 - 2012/01/19 (木) 22:46:30 - もくもくさん 他のロットのHindIII-HFでも同じ症状が出ますか？ 今お使いのロットがおかしいだけの可能性もあると思いますが。 そこらも含めて気軽にメーカーに問い合わせるのが第一かと思います。 意外にいちゃもんっぽい問い合わせでも（データがなくても）親切に調べて答えてくれますよ。

(無題) 削除/引用 No.51-13 - 2012/01/19 (木) 22:16:26 - くろーにん sin様 そこそこDNAワークの経験はあるのですが、私はstar活性に悩まされたことは一度もないので、このHigh Fidelity酵素の必要性は全く感じていません。余計なもの作りやがって、とか悪態ついています。しかし、別のHF酵素で問題が出たことが無いというのは大変参考になる情報です。なにせ大学のコアは全てHF酵素に入れ替わってしまっていたので。ありがとうございます。 安価様 私も「HindIIIのサイトがライゲーション前後で保存されているということ」まで品質保証してもらいたいと思います。一つの可能性ですが、HindIII-HFが認識配列を切断後、突出末端を削り取って平滑末端にしてしまい、それでHindIII-HFのみのシングルカットの場合はライゲーションがうまくいってコロニーが出たということもありえます（あまり考えにくいことですが）。コロニーつついてミニプレップし、Vector DNAを再度HindIII-HFで切って確認すればわかることなので、次回別件でコロニーをつつくときにやってみたいと思います。 「ベクターマルチマーの形態によっては形質転換されたコロニーが出てこないので、コロニーのでかたなどはサイエンスとして強い証拠にはなりません。」というのには、申し訳ないのですが賛同しかねます。HindIII-HFではコロニーが出ず、HindIIIではコロニーがでるというくっきりした現象の違いがあるのであれば、サイエンスとしてきちんと追求すべき問題と思うからです。上の「（シングルカットの場合で）HindIIIサイトの保存がライゲーションの前後で保存されている」ことが確認できれば、このような現象（HindIII-HFを含むdouble digestionでライゲーションがうまくいかない）が起こったが原因を追及してほしい、という形でカンパニーに報告しようと思っています。すぐに原因が突き止められるとは思っていませんが、サイエンスの問題として大事なことと思います。時間の無駄とかそういう問題ではありません。そもそも時間の問題で言えば、安価様おっしゃるとおりHFでないHindIIIを注文すれば良いだけの話ですしね。サイトが保存されていなかったら、クレームを入れる形のメールを出すことになります。

(無題) 削除/引用 No.51-12 - 2012/01/19 (木) 18:52:25 - 安価 ＞4) HindIII-HFのみ、あるいはXbaIだけでシングルカット（ともにNEB4使用）したベクターのライゲーションは問題がなかった。 多因子が絡むので、私の意見としてはHindIII-HFの品質保証は４）プラス再切断までということではないかと思います。HindIIIのサイトがライゲーション前後で保存されているということ。いろいろなマルチマーでライゲーションが成立し、ベクターマルチマーの形態によっては形質転換されたコロニーが出てこないので、コロニーのでかたなどはサイエンスとして強い証拠にはなりません。メーカーは困るでしょう。とくに交渉をやめろとはいいませんけど、私なら時間の無駄と思います。

(無題) 削除/引用 No.51-11 - 2012/01/19 (木) 13:17:42 - sin HindIIIの場合のHFの必要性は感じてないので使ってないのですが、少なくとも、他のHF、Sal等は良い感じで使えています。 くろーにんさんのような場合は不良品っぽいので、即、メ―カ―に聞いたほうが良いように思います。試薬業界の場合、ユ―ザ―は自分のミスかと思ってあまり言わないので、不良品を平気で出してくるような印象があります。逆の場合もあるとは思いますが、あまりコミニュケーションがないですよね。

(無題) 削除/引用 No.51-10 - 2012/01/19 (木) 12:32:56 - くろーにん 返事をくださった方々、ありがとうございます。 質問の仕方が悪かった点に気づきましたので、一度整理させてください。 1) HindIII-HFとXbaI（ともに推奨バッファはNEB4・・・って、昔XbaIの推奨バッファはNEB2でしたよね？）でdouble digesitionした場合、ライゲーションはうまくいかなかった。 2) HindIII-HF、ついでXbaIとシーケンシャルにdigesitionを行った場合も、ライゲーションはうまくいかなかった。 3) HindIII-HFを、古いHindIIIに変えてdouble digestion（NEB2使用）した場合は、ライゲーションがうまくいった。 4) HindIII-HFのみ、あるいはXbaIだけでシングルカット（ともにNEB4使用）したベクターのライゲーションは問題がなかった。 このような訳のわからない事態に遭遇された方はおられるでしょうか？ >中年様 最終的にはメーカーに問い合わせてみようかと思いますが、HindIII-HFだけで切った場合の再結合はなんら問題がなかったので、むこうも困るかもしれません。XbaIはとっくのとうに期限切れの古いものなので、これが問題じゃないかと言われるかもしれませんが、HindIII-HFをHindIIIに変えた場合はうまくいくので、いったいどうなっているのかわからずに頭を悩ませています。 >安価様、Harmonia様 申し訳ありません。ゲル上で再結合のチェックをする意味合いが未だによくわかっていません。HindIIIだけで切った場合の再結合は問題なくできることがわかったので、これ以上、特にゲル状で見る必要はないんですよね？

(無題) 削除/引用 No.51-9 - 2012/01/19 (木) 08:40:16 - Harmonia > No.51-7 ラムダDNAを制限酵素で切断、そのまま除タンパク処理（proKとフェノ抽）後、 ライゲーション、ということですね。 HindIIIなら、ライゲーションテストに使わなかった分を泳動マーカーに使えるので、無駄にはならない。 （近頃はマーカーをキャンペーンなどを利用して安価に買うのでしょうけど)

(無題) 削除/引用 No.51-8 - 2012/01/18 (水) 22:59:56 - 中年 ロット番号を指定してNEBに問い合わせては？

(無題) 削除/引用 No.51-7 - 2012/01/18 (水) 22:27:59 - 安価 お分かりの方には、非常にキツイいいかたになってしまいましたが、昔（いまは私の事情により知りません）タカラの制限酵素カタログに写真で明示されていたような、切断とその再結合をチェックしてみるべきということです。当然、直接的でないコロニーの出方ではありません。

(無題) 削除/引用 No.51-6 - 2012/01/18 (水) 22:11:46 - くろーにん 安価さん たしかに、値引きが無くとも安い酵素ですし、一本買えば少なくとも一年は持つでしょうから、注文して取り寄せるのがもっとも楽な手かもしれません。 ”セルフライげーションをゲルでチェック”というのは、制限酵素切断＞（ゲルからの切り出し・・・はシングルカットならいらないか？いや、完全に切断されているかどうかチェックが必要ですね）＞間を置いてゲルに泳動＞環状プラスミドの存在をチェックする、ということでしょうか？一度、HindIII-HFで切断後、T4 DNA ligase有り無しでligationして、コロニーの出方がどうなるか見てみたのですが、T4 DNA ligase無しの場合でもコロニーは10個以下程度でていました。同じ切り口の場合は、T4 DNA ligase無しでもいつもこれくらいのコロニー数が出ていたように記憶しています。 HFさん 末端からのヌクレオチド数は、vectorではHindIIIとXbaI間がだいぶあるので問題なし、PCR産物に関しては、プライマーに付加することで、3つヌクレオチド足しています。うーん、問題ないはずなんですがねぇ。 購入したHindIII-HFは新品で、ベクターをきちんとカットすることは確認済みです。切り口の突出末端に悪さをしたりすることがあるのか疑っていますが、疑いすぎだよなとも思っています。

(無題) 削除/引用 No.51-5 - 2012/01/18 (水) 19:23:11 - HF ぱっと思いつくことを。 ・PCR産物のHindIIIサイトの末端からの距離 http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/cleavage_olignucleotides.asp （一応、HindIIIとHindIII-HFでは反応性に違いは無いみたいですが・・・。） ・運悪く、持っていたHindIII-HFが、DNaseなどでコンタミしていた。 （新品ならこの可能性は無いでしょうが・・・。）

(無題) 削除/引用 No.51-4 - 2012/01/18 (水) 18:57:15 - 安価 その制限酵素はかなり安価ですから、その酵素だけ買えばいいのでは？ まじめに追求したいのなら、その制限酵素だけ（素性の違う）のセルフライゲーションをまずゲルでチェックするべきでしょう。

UV 削除/引用 No.51-3 - 2012/01/18 (水) 17:00:11 - くろーにん mon 様 ありがとうございます。しかし、UVは一切当てていない（20ulの制限酵素処理液を作ったとして、うち2ulだけを切り出し用のレーンの脇に流して、これだけをEtBrで染めている）ので、UVの当てすぎということはないと思います。

(無題) 削除/引用 No.51-2 - 2012/01/18 (水) 15:21:29 - mon UVの当てすぎ？

NEBのHigh Fidelity制限酵素について 削除/引用 No.51-1 - 2012/01/18 (水) 14:09:00 - くろーにん 最近、数年ぶりにベクター構築作業を始めたものです。 NEBの制限酵素でvector、PCRで増幅したフラグメントの両端を二種類の制限酵素で切断したものをligationして、とある遺伝子の発現ベクターを作成しています。 数年この手の作業から離れていて知らなかったのですが、現在NEBから使用頻度の高い制限酵素群でHigh Fidelityのものが売り出されているのですね。EcoRI-HFやHindIII-HFなど。 このHigh Fidelity制限酵素で切れるのはきちんと確認できるのですが、切った後ligationに持って行くと、なぜかうまくいかないのです。具体的には、HindIII-HFとXbaIをNEB4 Bufferを使用（BSAも入れました）してdouble digesitionした後にDNAを切断後アガロースゲルに流して目的のサイズのフラングメントを切り出して、T4 DNA ligaseを4C O/Nで使用してligationを行い、トランスフォーメーションしてLB plateにまいたところ、コロニーが出ない、という次第です。 制限酵素がきちんとDNAを切断することは、single digestionでもdouble digestionでも確認できていますし、また、T4 DNA ligaseがへたったりしていないことも確認済み（XbaIでシングルカットしたvectorを再度繋いで確認）です。 理由はわからないけれども、どうしてもこのHigh Fidelity制限酵素が問題のような気がして、知り合いに古いストックのHindIIIを借りて上記の作業を行ったところ、問題なくコロニーが出ました。 上記のように、High Fidelity制限酵素を使ってクローニングに問題が出た方はおられますでしょうか？また、問題が出たがこうやって解決した、という方はおられませんでしょうか？ 古いHind IIIがあるうちは良いのですが、それほど量がありません。うちでは大学のコアラボから制限酵素を格安で買えるのですが、最近コアラボはHigh Fidelityのものが存在する制限酵素に関しては、それしか仕入れていないようで、将来的に困ったことになるのではないかと危惧しています。 よろしくお願いします。

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