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(無題) 削除/引用 No.5103-12 - 2016/05/30 (月) 11:32:35 - RCP >SYBR master様 ご指摘ありがとうございます。 溶液は使用前にタッピング＆スピンダウン、さらに使用直前に軽くピペッティングして使用しいました。 ですが私自身大雑把な性格だと自負しておりますので、今後は一層気を付けて濃度差の出ないように注意して行いたいと思います。ありがとうございます。 チューブの品質には気を付けていませんでした・・・ それが結果に影響するということもあるのですね！ 早速ラボで相談してみたいと思います。 （貧乏ラボのため、採用してもらえるかどうかわかりませんが頑張ります！汗） ありがとうございます！！

(無題) 削除/引用 No.5103-11 - 2016/05/28 (土) 23:57:13 - おお 考古学と法医学のDNA鑑定などは定量するんじゃなくって、配列を読まないと行けないのでかなり厳しいんだと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.5103-10 - 2016/05/28 (土) 18:24:10 - SYBR master 印象として、 1. 各凍結溶液を溶解したときに、溶解後の液の上層と下層で濃度差が出ていることに気がついていない?premixを作成する前に、各溶液をよく混ぜましょう。他の人ができるのであればこれが一番可能性が高い。特にPCR primerの濃度のばらつきは、濃度でTmが変化するので結果がぶれやすいです。 2. premixを1.5 mLチューブ等で作成する場合、なるべく吸着の少ないDNA- Lo bindなタイプを使用する。普通のものでも問題がないことの方が多いのですが、たまに吸着が著しくひどいロットのもの(たぶん金型が古くなり始めて、内部表面がざらついているのか？）があるので、品質保証のあるものを使用する。 3. 同様にfilter tipもLow-bindなものを使うと安定することがあります。 おお様 >クリーンベンチでやる意味がイマイチわかりません。 PCR-work stationの代わりに使うのは、医学系なら普通のことだと思いますよ、コンタミ防ぐために。ちなみに、さらに考古学と法医学のDNA鑑定ならクリーンルーム+クリーンベンチで行わなければデータとして認められません。

おお様 削除/引用 No.5103-9 - 2016/05/28 (土) 00:25:55 - RCP なるほど！それは確かにあるかもしれません💡 盲点でした。以後統一しようと思います。ありがとうございます！ しかし同じピペットマンを用い、同じプレート上に同じDNAで 複数のプライマーで試してみたとき、その内幾つかだけおかしかったというのは やはりそのプライマーが良くないからなんでしょうか。 ですが同じプライマーで同様の実験をしている研究室内の友人から、 あまりぶれたことがなかったという話を聞いて、混乱しています… 検量線Ｒ2が0.99で、1DNAに対し2ウェルのデュプリの結果誤差が少ないため、 手技ではないのかなと思いつつ、やはり手技なのかなとも思っています。 今のままだと実験をしてみて、検量線を見て一か八か！の状態なので、 出来ることであればなんでも試したいです。 混乱した状態ですが、ご回答頂けて大変感謝しております。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5103-8 - 2016/05/28 (土) 00:16:45 - おお ピペットそれぞれがぶれているため毎回違う増幅効率に見えるという可能性はないですか？

おお様 削除/引用 No.5103-7 - 2016/05/28 (土) 00:04:36 - RCP いえ、特に決めていないですし、研究室内で共用のものなので同じものは使っていません。

(無題) 削除/引用 No.5103-6 - 2016/05/28 (土) 00:03:28 - おお ちなみに毎回同じピペットを使ってますか？

ＡＰ様 削除/引用 No.5103-5 - 2016/05/27 (金) 23:49:56 - RCP 今再度読み直したら、見当違いな回答をしていたことに気が付きました！ すみません… プライマーの希釈溶液、教えて頂いたものを含め再度検討してみます。 ありがとうございました。

お返事ありがとうございます 削除/引用 No.5103-4 - 2016/05/27 (金) 23:47:50 - RCP ご回答ありがとうございます。 ＡＰ様 プライマーの希釈ですが、大元のプライマーをTEを用いて希釈し、 希釈したその日に用いています。 スタンダードの希釈は、タカラの逆転写酵素のキットに付属していた EASY DYLUTIONを用いて行っています。 （DNAの濃度が薄い場合に適するとあったので） ちなみに、スタンダードは1/5〜1/80でふっています。 希釈時に用いる溶液は、仰る通り市販品で行うのが良いのでしょうか…。 おお様 100%になるのがブレだと言うのは重々承知しております。 そうなると、そのプライマーが良くないのかなと思っており、 やはり新しく設計し直そうと考えています。 クリーンベンチで実験をしたのは、原因として実験時の落下埃などが混入しないようにするためでした。 いつもはクリーンベンチではなく、実験台で行っています。確実にコンタミなどが起こらないように一度クリーンベンチでやってみれば？とボスに言われたので今回、複数のプライマーで一度に検量線を引いてみましたが、そのうち2つがやはりおかしいなという結果でした。（クリーンベンチ使用時はエアを切っていますので、蒸発しやすいということはないと思います。） 周囲に「普通PCRはクリーンベンチで行うもので、原因はコンタミか手技に違いない」と言われておりましたのでおおさんのご意見大変ありがたかったです。 次回から実験台に戻します。 こうなるとやはり、PCRの機械の問題なのでしょうか…

(無題) 削除/引用 No.5103-3 - 2016/05/27 (金) 23:30:59 - おお >100％と信頼度が高い検量線が同一プライマー・DNAで >作成できるときもあるので、 １００％になるのが実験のブレの結果で、本来の値ではないという見方はできないですか。。。 クリーンベンチでやっているので、溶液が乾いたりして容量が変わったりとかそういうことが起こってないですか。クリーンベンチでやる意味がイマイチわかりません。空中にいる可能性がある菌などを扱ってるのですか？

(無題) 削除/引用 No.5103-2 - 2016/05/27 (金) 19:38:00 - AP プライマーやテンプレートは、特に低濃度では容器壁に吸着される影響が大きくでます。 希釈はなるべく使用直前にして長期間の保存を避ける、希釈溶媒は吸着ロスを防ぐためキャリアーや界面活性剤がはいったものを使う（市販品もありますが、BSA, Triton X-100, linear acrylaminde, yeast tRNAなどが入ったもの）で改善しませんか？

PCR　増幅効率の変動 削除/引用 No.5103-1 - 2016/05/27 (金) 16:47:52 - RCP RT-PCR検量線の、増幅効率の値について質問があります。 同じプライマー・同じDNAを用いて複数回PCRを行ったことがあるのですが、 検量線の増幅効率がそのたびに大きく変動してしまいます。 （150％くらいになったり、100％になったり、80％になったりします） 100％と信頼度が高い検量線が同一プライマー・DNAで 作成できるときもあるので、プライマーが悪かったり DNAの精製度が悪いということもないのかなと考えています。 （同じ現象が他のプライマーでも生じています） PCR時の条件は以下の通りです ・動物種　ラット ・逆転写酵素　TOYOBO ReverTra qPCR RT Master Mix ・PCR酵素　TaKaRa　SYBR Tremix Ex Taq2 ・クリーンベンチ内でウェルにアプライ ・Applied Biosystem社 7300使用 ・検量線　R2は0.99以上です 少し古いプライマーを使用することがあったため、現在新しく発注しなおす予定でいますが、その他原因が考えられましたらご教授いただきたいです。 宜しくお願いいたします。

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