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ペプチド特異的CTL cloneの樹立について トピック削除
No.5124-TOPIC - 2016/06/02 (木) 22:54:26 - Fj
お世話になります。

私は現在がん抗原のエピトープペプチドの同定を行ってるのですが、ペプチド特異性が確認されたCTLからCloneを樹立しようとするとcloningを終えた時点で特異性が消失してしまい思うように実験が進みません。
以下に詳細を記載しますので、どなたかアドバイスいただけませんでしょうか。

CTL induction
PBMCから分離したCD8+細胞にペプチドをパルスしたautologous DCをAPCとして加え刺激を与える。
これを3回繰り返した後、IFN-g ELISPOTでペプチド特異性を確認しています。

ここで特異性の見られたCTLからCTL cloneを樹立しようと思いlimiting dilutionを行っています。

3cell、1cell、0.3cell/wellになるように細胞懸濁液を調整しそれぞれ、96 well U-bottom plateに播種。
培地は5% Human Serum TypeAB/AIM-Vに125U/ml IL-2、40ng/ml Anti-human CD3 Abを添加したものを用い、フィーダー細胞としてJiyoyeとEB-3をそれぞれ1×10^4 cells/wellで加えています。
適宜培地交換をしつつ2週間培養し、細胞が増殖しているwellのみをピックアップしてELISPOTで特異性を確認(この時点で増殖していないwellは特異性があったとしても樹立後に増えにくくて使えないと思い排除しています)。

ここでペプチド特異性が消失して確認できなくなってしまいます。

以前、別のペプチドでは同じ方法で特異的CTL cloneを樹立できた経験はあるのですが、何が違うのかがよく分かりません。

ボスとも相談したのですが「Inductionの時まではELISPOTのspot数も多く、綺麗に出ていてしっかりとしているのにlimiting dilutionしたら何故特異性が無くなるのか訳分からん」とよくわからない様子でした。

cloning中に何らかの刺激が入って特異性が消失したり、2週間cultureした程度では増殖能の高い非特異的な細胞だけが増えて肝心の特異的CTLがいるwellは全然増殖していないといったこともあるのでしょうか。

皆様のからのコメントお待ちしております。
何卒宜しくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.5124-4 - 2016/06/03 (金) 20:24:20 - Fj
IP様

ご指摘の通り「反応性が消失した」ということです。
不正確な情報をお伝えして申し訳ございません。

TCRの発現は確認しておりませんが、cloningのおける刺激培養の過程でTCRの発現が低下することがあるのでしょうか。
また、テトラマーに関しては今回CTLを誘導できたペプチドがロングペプチドで、どのような配列でプロセシング後に提示されているのか分からないため作成しておりません。

ペプチドは最初に使用したものと同じものです。
前回使用したものをfreeze and thawして使用したのですが、何度も繰り返している訳ではないので特に問題はないと思います。

コンタミに関しては特にそのような心当たりはありませんが、絶対にないかどうかは断言できかねます。

何かお気付きの点等ございましたらご助言宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用
No.5124-3 - 2016/06/03 (金) 04:06:07 - IP
すみません、再度の投稿です。

最初の特異性を見る際に使ったペプチドと、今回は同じものを用いていますか？
最初のペプチドにペプチド以外のものがコンタミしていた、という可能性はありませんか？

(無題) 削除/引用
No.5124-2 - 2016/06/03 (金) 04:04:10 - IP
> ここでペプチド特異性が消失して確認できなくなってしまいます。

ペプチド特異性ではなく、ペプチド反応性が消失した、ですよね？

TCRの発現は確認できていますか？
peptide-MHC tetramer bindingはいかがですか？

ペプチド特異的CTL cloneの樹立について 削除/引用
No.5124-1 - 2016/06/02 (木) 22:54:26 - Fj
お世話になります。

私は現在がん抗原のエピトープペプチドの同定を行ってるのですが、ペプチド特異性が確認されたCTLからCloneを樹立しようとするとcloningを終えた時点で特異性が消失してしまい思うように実験が進みません。
以下に詳細を記載しますので、どなたかアドバイスいただけませんでしょうか。

CTL induction
PBMCから分離したCD8+細胞にペプチドをパルスしたautologous DCをAPCとして加え刺激を与える。
これを3回繰り返した後、IFN-g ELISPOTでペプチド特異性を確認しています。

ここで特異性の見られたCTLからCTL cloneを樹立しようと思いlimiting dilutionを行っています。

3cell、1cell、0.3cell/wellになるように細胞懸濁液を調整しそれぞれ、96 well U-bottom plateに播種。
培地は5% Human Serum TypeAB/AIM-Vに125U/ml IL-2、40ng/ml Anti-human CD3 Abを添加したものを用い、フィーダー細胞としてJiyoyeとEB-3をそれぞれ1×10^4 cells/wellで加えています。
適宜培地交換をしつつ2週間培養し、細胞が増殖しているwellのみをピックアップしてELISPOTで特異性を確認(この時点で増殖していないwellは特異性があったとしても樹立後に増えにくくて使えないと思い排除しています)。

ここでペプチド特異性が消失して確認できなくなってしまいます。

以前、別のペプチドでは同じ方法で特異的CTL cloneを樹立できた経験はあるのですが、何が違うのかがよく分かりません。

ボスとも相談したのですが「Inductionの時まではELISPOTのspot数も多く、綺麗に出ていてしっかりとしているのにlimiting dilutionしたら何故特異性が無くなるのか訳分からん」とよくわからない様子でした。

cloning中に何らかの刺激が入って特異性が消失したり、2週間cultureした程度では増殖能の高い非特異的な細胞だけが増えて肝心の特異的CTLがいるwellは全然増殖していないといったこともあるのでしょうか。

皆様のからのコメントお待ちしております。
何卒宜しくお願い致します。
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