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(無題) 削除/引用 No.5130-19 - 2016/06/06 (月) 12:30:43 - おお 他のがん細胞は試してないのですか？発現が低い細胞だったら�@でも効果が出るとか、、、

(無題) 削除/引用 No.5130-18 - 2016/06/06 (月) 09:48:33 - Rescue 一応確認ですが、shRNAなので導入効率は100%（安定細胞株を選択）で、ターゲットの発現抑制をウエスタン（タンパクレベル）で見ると、�@50%減、�A80%減、という結果になるという解釈で良いですか？ その場合、NFκB活性やEMT/CSCマーカー発現では、�@と�Aでどの程度の違いになるのでしょうか？　どうも残存発現量による表現形の差を見ているような気がしてきました。もし�@ではNFκB活性が抑制されないなら、�Aの結果で先に進めても良いような気もしますが、レスキュー実験をスキップする場合は、他の方法でNFκB活性を動かした時にどうなるか確認しておいた方が安心かと思います。阻害剤でNFκB活性をノックダウン�Aで見られるレベルまで下げた場合の表現形を見ておくと良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.5130-17 - 2016/06/06 (月) 09:27:23 - 実験初心者 > では５０％の抑制ではフェノタイプは得られないと言う結論で、そこをどううまく説明するかという話ではないでしょうか。それと別にオフターゲットについては慎重に勧めたほうがいいです。 ありがとうございます。そうですね。そのようにしてみます。 > 50%のノックダウンで表現系がみられないのはよくあることだし、3回もレンチ感染させてたら細胞が形質転換起こしてもおかしくない そもそも、「論文作成の際には”都合が悪い”」とか自分の仮説通りに絶対に実験がうまくいくと過信している姿勢がおかしい 今なら、CRISPR/Cas9系でノックダウンしたほうが表現系ははっきりでるだろうし、reviewerにも指摘されるんじゃないだろうか ありがとうございます。ご指摘の通りだと思います。 私の投稿論文レベルが低いためか、統計ひとつとっても怪しい、よくそういった意図を感じる論文を拝見します。CRISPR/Cas9も行いたいです。が、諸事情でハードルが高いです。

(無題) 削除/引用 No.5130-16 - 2016/06/06 (月) 09:11:41 - おお では５０％の抑制ではフェノタイプは得られないと言う結論で、そこをどううまく説明するかという話ではないでしょうか。それと別にオフターゲットについては慎重に勧めたほうがいいです。

(無題) 削除/引用 No.5130-15 - 2016/06/06 (月) 09:10:53 - ss 50%のノックダウンで表現系がみられないのはよくあることだし、3回もレンチ感染させてたら細胞が形質転換起こしてもおかしくない そもそも、「論文作成の際には”都合が悪い”」とか自分の仮説通りに絶対に実験がうまくいくと過信している姿勢がおかしい 今なら、CRISPR/Cas9系でノックダウンしたほうが表現系ははっきりでるだろうし、reviewerにも指摘されるんじゃないだろうか

(無題) 削除/引用 No.5130-14 - 2016/06/06 (月) 09:05:54 - 実験初心者 >�@50%減、�A80%減程度です。 だから�@では効果が見れないという風には考えないのはなぜですか？�Aで導入量を減らして５０％ぐらいにした時はどうなりますか？ 私はそのように考えているのですが、今まで２系統で上手くいってきたのだから、ラボのボスは２系統でという意図なのです。なぜか誰も納得してくれないのです・・・。 �Aも検討済です。 50%程度の際も有意差は出ないですが、シグナルレベルは変化しています。

(無題) 削除/引用 No.5130-13 - 2016/06/06 (月) 08:48:25 - おお >�@50%減、�A80%減程度です。 だから�@では効果が見れないという風には考えないのはなぜですか？�Aで導入量を減らして５０％ぐらいにした時はどうなりますか？

(無題) 削除/引用 No.5130-12 - 2016/06/06 (月) 08:07:39 - 実験初心者 おお様 すみません、ありがとうございます。 phenotypeを見ているpointとパスウェイでチャンピオンの得られたpointは確かに異なります（継代数でいうと2,3回程度です、もちろんその際もウエスタンで評価しており、同様の結果は得られていますが・・・）。 ラボでは許容される範囲とされていますが・・・

(無題) 削除/引用 No.5130-11 - 2016/06/06 (月) 08:02:05 - おお >私の場合はK/D効率によりパスウェイが逆に動いたり、タンパク量が異なったりしていることも判明しています。 これは重要なところじゃないですか？ >私もshの系で、K/D効率が悪い事、細胞障害がひどいので、レシュキュー実験は考えていません。 状況が把握できませんけど、もう少し詳しく書いたほうがいいのでは？

(無題) 削除/引用 No.5130-10 - 2016/06/06 (月) 08:01:29 - 実験初心者 Rescue様 ＞普通に考えて、ノックダウン�@とノックダウン�Aで、目的とするシグナル伝達系とその標的が同様に抑制されているにもかかわらず、ノックダウン�Aでのみ表現形が見られる場合、そのシグナル伝達系とは無関係におきている現象と考えるべきかと思います。よって、ノックダウン�Aで見られる表現形はオフターゲットと考えるのが妥当のような気がします。レスキュー実験を組まないと、説得力のあるデータにはならないような気が、、、 使用している細胞はk/d効率が悪く、レンチによるshによる系で3回感染させており、細胞障害が強く出ています。つまり、レスキュー実験はなかなか難しいと思います。 ノックダウン効率はウエスタンのdensitoで�@50%減、�A80%減程度です。 >ただし、逆にノックダウン�@のオフターゲット効果により、ノックダウン�Aで見られている、本来出るべき表現形が抑制されている可能性も完全には否定できませんので、もう一つ別のshRNAを試してみても良いような気がします。 コンストラクトは計4つ行い、効率のよい２つを選んで行っています。 そのシグナル伝達系の阻害剤、あるいは下流の転写因子の抑制（ノックダウンあるいは阻害剤）で、ノックダウン�Aで見られる表現形が再現される事は確認されてますか？　また、ノックダウン�@とノックダウン�Aの細胞で、抗がん剤処理をした場合にも、そのシグナル伝達系の反応が同様であることも確認済みでしょうか？ ＞　NFκB活性を見ているのですが、阻害剤では確かにphenotypeは同様の傾向を示しています。確認済みです。阻害剤でsupplmentも考えていますが、やはり望ましいのはノックダウン�Aでしょうね。 　　抗癌剤耐性のEMTマーカー、CSCマーカーが動いていますが、phenotypeは�Aのみです・・・

(無題) 削除/引用 No.5130-9 - 2016/06/06 (月) 07:56:52 - おお >よって、ノックダウン�Aで見られる表現形はオフターゲットと考えるのが妥当のような気がします。 わたしも最初これがよぎりました。まあでもオフターゲットを否定する実験を組まないとおそらく納得しないかなぁと思いましたので。またオフターゲットと断言するには弱いかと思いましたので。確かにもう一つ違うターゲットサイトでノックダウンをやってみるといいかもしれませんね。 もう一つはその上流下流のいろいろなポイントでブロックをかけたり、エンハンスしてみて、アウトプットに期待通りの変化があるか見ていくことで強化できるだろうなぁとおもいました。 フェノタイプをみてタイムポイントと、シグナルや転写因子を見ているタイムポイントは一緒ですが？フェノタイプを見ている時期には片方ではもうKD効果が弱くなってしまっているという可能性はありませんでしょうか。フェノタイプを見るタイムポイントでKD効果を見てなかったら一度見てみることも考えたほうかがいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5130-8 - 2016/06/06 (月) 07:52:57 - 実験初心者 CD様 ありがとうございます。 確かにオフターゲットの否定は難しいですよね。 私の場合はK/D効率によりパスウェイが逆に動いたり、タンパク量が異なったりしていることも判明しています。 実験費との問題もあります。私はできる範囲で網羅的にPCRをしました。 私もshの系で、K/D効率が悪い事、細胞障害がひどいので、レシュキュー実験は考えていません。

(無題) 削除/引用 No.5130-7 - 2016/06/06 (月) 04:49:26 - Rescue 普通に考えて、ノックダウン�@とノックダウン�Aで、目的とするシグナル伝達系とその標的が同様に抑制されているにもかかわらず、ノックダウン�Aでのみ表現形が見られる場合、そのシグナル伝達系とは無関係におきている現象と考えるべきかと思います。よって、ノックダウン�Aで見られる表現形はオフターゲットと考えるのが妥当のような気がします。レスキュー実験を組まないと、説得力のあるデータにはならないような気が、、、 ただし、逆にノックダウン�@のオフターゲット効果により、ノックダウン�Aで見られている、本来出るべき表現形が抑制されている可能性も完全には否定できませんので、もう一つ別のshRNAを試してみても良いような気がします。 そのシグナル伝達系の阻害剤、あるいは下流の転写因子の抑制（ノックダウンあるいは阻害剤）で、ノックダウン�Aで見られる表現形が再現される事は確認されてますか？　また、ノックダウン�@とノックダウン�Aの細胞で、抗がん剤処理をした場合にも、そのシグナル伝達系の反応が同様であることも確認済みでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5130-6 - 2016/06/06 (月) 01:13:38 - CD 横槍になってすみません。 ＞シグナル解析ではノックダウンすることで、2系統とも目的遺伝子や仮説の対象とした転写因子などが抑制されたということです。 これって、ノックダウンした目的遺伝子＋目的遺伝子が影響を及ぼすであろう遺伝子の発現が変化したということをqPCRかなにかで検討したということでしょうか？これだとオフターゲット云々の話はあまり関係ないような感じもします。 自分はprimary細胞にsiRNAを導入しているのですが、レスキュー実験が容易にはできないためオフターゲットの否定をうまくできたらなあと思案していました。良い手があれば教えてもらえればと思います。

(無題) 削除/引用 No.5130-5 - 2016/06/05 (日) 22:08:57 - 実験初心者 > 効率の問題はもちろんあるのですが・・・。 効率が違うならそれを評価にかみしないと行けないのでは？ 効率の問題でしょうか、因果関係はわかりませんが、コントロール細胞とphenotypeにおいては有意な差が得られないものが多いです。系にももちろんよるのですが、keyとなるアッセイ（抗癌剤耐性や遊走能）に差が得られないので、論文作成の際には”都合が悪い”のです。 多くの論文では1系統だけ表記していたり、なぜ他のコンストラクトがダメだったか明記していないこともあるのでどう表記すればよいかわからなく投稿いたしました。 シグナル解析ではノックダウンすることで、2系統とも目的遺伝子や仮説の対象とした転写因子などが抑制されたということです。肝心のphenotypeが出ない事が問題かと思います。

(無題) 削除/引用 No.5130-4 - 2016/06/05 (日) 11:26:25 - おお >[Re:3] 実験初心者さんは書きました : > 効率の問題はもちろんあるのですが・・・。 効率が違うならそれを評価にかみしないと行けないのでは？ > > シグナルレベルでは、オフターゲットの否定には可能かと考えています。 具体的にどういったことでしょうか。よく理解できてないので説明いただけますか？

(無題) 削除/引用 No.5130-3 - 2016/06/05 (日) 10:26:38 - 実験初心者 ありがとうございます。 もちろんmRNA、タンパクレベル等も全て確認しております。 その結果考えうるパスウエイ変化もほぼ同様の結果ではあります。 効率の問題はもちろんあるのですが・・・。 シグナルレベルでは、オフターゲットの否定には可能かと考えています。

(無題) 削除/引用 No.5130-2 - 2016/06/05 (日) 10:19:13 - おお 蛋白は見てないんですよね、、、shRNAなど、mRNAを切る場合と翻訳阻害する場合があるから、�Aは翻訳レベルでもきいてて、�@はそのレベルではきいてないとか、、、 まそれはともかくとして、オフターゲットの否定を何らかの実験ですればいいでしょう。�AでshRNAに耐性になるような配列をもつその遺伝子の発現ベクターを導入して�Aの効果を抑制できるとか。 また、�Aがもっともらしいと思える他の実験を多角的に蓄積させるとか。

ノックダウン 削除/引用 No.5130-1 - 2016/06/05 (日) 10:04:23 - 実験初心者 失礼いたします。 ノックダウン実験における論文での表記につきましてご相談をと思い、トピックを立てさせていただきました。癌細胞株実験において、shRNA techniqueを用いたノックダウン実験を異なる二つのコンストラクトで行っております。 遺伝子レベルの変化 (ノックダウン直後です)においてはノックダウン�@、ノックダウン�Aともほぼ同じ動きを示すのですが、表現型がノックダウン�Aのみ仮説どおりでノックダウン�@はコントロール細胞と差はありません。 遺伝子レベルの変化により、表現型の説明は可能であるとして、論文の記載をどのようにしたらよいか、論文での見せ方等悩んでいます。 何かアドバイスをいただければと思います。よろしくお願い致します。

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