tracker様
> 0.1mgの目的タンパク質が5mlのグルタチオン担体に結合しているという解釈で合っていますでしょうか。
> そうだとしたら担体が大過剰で、担体上の目的タンパク質の密度がかなりスカスカな状態ですよね。
5 mLのグルタチオン担体に対して、1.88 mgの目的タンパク質が結合しています。かしながら、担体が大過剰であることには変わりないと思います。
> プロテアーゼ自体にGSTタグがついているなら当然プロテアーゼも担体にトラップされるので、ある程度担体上で目的タンパク質の密度がないと目的タンパク質-プロテアーゼの接触機会の確保が難しいように思います。
> こういうタンパク精製用のアフィニティー担体って大抵1mlもあれば10mgとかのGST融合タンパク質を釣れるくらいの吸着容量があると思うので、私ならもっと少ない担体にその0.1mgのタンパクを吸着させて切断反応を行います。
使用する担体量および溶媒量を減らすことを検討してみます。
現在の半量でしたら可能だと思います。
現在、担体への結合は、50 mLチューブで50 mLの溶液に対して1 mLの担体で行っていますので、極端に減らすのは難しいかもしれません。
> ちなみにスモールスケール時の目的タンパク質の量と担体量を教えていただけますでしょうか。
スモールスケール時のタンパク定量を行っていないので、正確にはわかりません。
スモールスケールでは、BL21を4 mL培養×１に担体30 µLを使用しました。
今回は、BL21を3 L培養×4に担体4 mLを使用しました。
> あ、担体の量を変えられないなら一度溶出して可溶化状態で切断反応を行って、脱塩後にグルタチオン担体でGSTとプロテアーゼを除去するっていうのもアリです。(切断反応前に脱塩の方がいいか？)
考えておりませんでした。
一度詳細に検討してみます。 |
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