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(無題) 削除/引用 No.5155-8 - 2016/06/27 (月) 22:32:42 - 中年 ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは重合するのでクロスリンクする標的の間の距離に柔軟性があるのがメリットです。

(無題) 削除/引用 No.5155-7 - 2016/06/27 (月) 12:20:38 - ANO 未知のもの、、、 未結合のものと、結合済みのものを、何らかの 結合反応後に、どのように分離するのかも考えないと

(無題) 削除/引用 No.5155-6 - 2016/06/22 (水) 23:16:09 - おお EDTAや還元剤の非存在下でCuCl2（１００uMぐらい）加えると近傍にあるCys同士がS-S結合で架橋されます。一つの選択肢かと。

(無題) 削除/引用 No.5155-5 - 2016/06/22 (水) 19:04:15 - mon 私が提案した方法は、未知タンパクを化学的にビオチン標識してそれを目印に抽出する方法で、既知タンパク(bait)がビオチン標識されていると未知タンパクの同定は難しいでしょう。 ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドを用いた架橋法の欠点は、未知タンパクの分子量が安定しない・トリプシン消化が難しくなる等の理由で、MS/MSでの同定が困難になることです。 未知タンパクの回収はpull-downでしょうか？その後の同定法まで考えて選択してください。

(無題) 削除/引用 No.5155-4 - 2016/06/22 (水) 15:16:01 - ラックタイ monさん、おおさん 返事が遅くなり申し訳ございません。 そしてご提案ありがとうございます。 ＞monさん 私が用いるbaitタンパク質にはavi-tagを付加していてビオチン標識させたものです。sulfo-SBEDはビオチン標識するとのことですがクロスリンクに影響でないでしょうか？ ＞おおさん ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドを用いた架橋は一般的のようですね。確かに大体のラボにありますし、まずは手っ取り早く試せそうです。最初に試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.5155-3 - 2016/06/13 (月) 21:45:00 - おお 確かにクロスリンカーがそれなりの種類がありますので、ある程度はあたりをつけるのが無難です。クロスリンクしてWBでクロスリンクしたブロダクトが見れるかなどで評価ができる場合があります。私のクロスリンカーの第一選択肢はフォルムアルデヒドかグルタルアルデヒドです。身近にあって買う必要もないし、買って少量使ってまた使おうというとき消費期限が過ぎてたとかのムダもあまりないから。

(無題) 削除/引用 No.5155-2 - 2016/06/13 (月) 20:49:19 - mon sulfo-SBEDかな。近傍20A近辺のタンパクをビオチン標識出来ます。 既知タンパクに特異抗体があるならビオチンチラミンを利用する方法があります。 100A近辺のビオチン標識出来ます。

未知の相互作用タンパク質とを架橋させる 削除/引用 No.5155-1 - 2016/06/13 (月) 16:56:29 - ラックタイ はじめまして。 私自身過去に用いたことがないので、経験豊富な方のアドバイスをお願いします。 既知のタンパク質と相互作用(結合）するタンパク質のスクリーニングを行っているのですが、結合そのものがあまり高くないのか既存の相互作用タンパク質(ポジコンとして使用）でも結合がみられるものとみられないものがあります。 結合が弱いものを含め、未知の相互作用タンパク質との結合を強固にするために架橋剤を用いたクロスリンク法を検討したいと思うのですが、タンパク質架橋剤の種類が多いこともあり、何を使うのが良いのか頭を抱えています。既知同士ならば選択肢も限られるのでしょうけど、未知のタンパク質との結合に用いるという目的の場合に、注意点やどういった架橋剤を用いるのが推奨されるのか、ご教授願います。 よろしくお願いします。

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