Bio Technical フォーラム

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qPCRの統計解析について トピック削除
No.5230-TOPIC - 2016/07/10 (日) 12:01:34 - 初学者
初めまして。今年の4月より研究を始めた初学者です。
統計解析手法について質問させていただきたいのですが、大変初歩的なことだとは存じますが、ご教授いただけますと幸いです。

今、マウス初代血管内皮細胞を6ウェルプレートにまき、一定濃度の薬剤で0、1、6時間と刺激しました。コントロールとしては無刺激のものを1、6時間後に回収しました。ポジティブコントロールとして、LPSで6時間刺激したものを用意しました。以上が6ウェルの内約です。


TNFalpha, IL-6のmRNAをqPCRにて調べると、LPS刺激では両遺伝子の100倍程の発現誘導が見られました。

一方、サンプル群である、薬剤処理した場合には、無刺激のものに比べ、

1時間の時点:5倍差
6時間の時点;50倍差

が認められました。以上のことから、この薬剤には炎症を惹起する作用がある可能性が示唆されます。ただ、これら各サンプルは1ウェルのデータであり、検体数は1となるようです。

ここで2つ質問させてください。
まず、上記のような実験はあくまで予備的な検討であり、ポジティブなデータが出そうだということであれば次にすることは、6ウェルプレート3枚分に細胞を撒き、検体数3で次回同様の実験を行うべきなのか、

それとも、検体数1のまま、全く同じ実験をあと2回行い、合計3回の実験データを統合して統計解析を行うべきかのどちらが正しいでしょうか?

またこの時、前者からは標準偏差が、後者からは標準誤差が算出可能という理解で大丈夫でしょうか?

もう一つの質問は、データの信頼性を高めるために検体数を増やす必要がありますが、統計解析も標準偏差よりも標準誤差の方を付した方が良いと読みました。標準誤差の求め方をエクセルで行う際には、"=STDEV/SQRT(検体数)"という演算式でいいでしょうか?

入門本も読んだのですが、再確認の意味もあり、トピックを立てさせていただきました。
非常に初心者的で未熟ものではありますが、ご教示いただけますと幸いに存じます。
 
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(無題) 削除/引用
No.5230-24 - 2016/07/20 (水) 00:13:26 - 通りすがり
私自身はWilliamsの検定しか経験がないのですが、Jonckheere-Terpstraも似たようなものだとに思っています。違ったらすいません。

 mbbさんが仰る"非線形回帰"の真意を掴みかねている部分がありますが、もちろん相関係数でディスカッションできる場合もあると思います。ですが、相関係数でディスカッションできないような場合には別の手法(ex.傾向性の検定)が必要です。「一方が増加すれば、他方も増加する」という相関で、回帰直線(曲線)を描くような相関がない場合(cf.No.5230-21)はその一例です。この場合でも、回帰できる用量範囲だけ取り出して線形回帰(相関係数)でディスカッションする手もあります。

 用量反応の検定手法はゴールデンスタンダードがなく、一つに絞れない難しさがあります。傾向性の検定では生理的に意味がある用量を選べば、たとえそれが回帰曲線に落とし込めなくても解析できる強みがあります。しかし、おおさんのお示しいただいたページにあるように、用量反応の逆転に非常に弱いです。

(無題) 削除/引用
No.5230-23 - 2016/07/16 (土) 02:57:08 - おお
med.osaka-u.ac.jp/pub/kid/clinicaljournalclub17.html

sarcopenia.jimdo.com/%E3%82%B5%E3%83%AB%E3%82%B3%E3%83%9A%E3%83%8B%E3%82%A2%E7%A0%94%E7%A9%B6%E3%81%AE%E3%81%9F%E3%82%81%E3%81%AE%E7%B5%B1%E8%A8%88%E5%AD%A6/spss%E3%82%92%E4%BD%BF%E3%81%A3%E3%81%9F%E3%83%88%E3%83%AC%E3%83%B3%E3%83%89%E6%A4%9C%E5%AE%9A-trend-test/


検索にかかったホームページを示しているだけで、検証してませんけど二群間のTテストなどで有意差が出ないほどのものでも増加傾向があればこのような検定で有意差が出るようですね。どのように計算しているのか概念的な部分だけでも知りたいような気がします。

(無題) 削除/引用
No.5230-22 - 2016/07/15 (金) 13:10:46 - mbb
>[Re:21] 通りすがりさんは書きました :
> 用量反応について私も勉強中の身ですが。。。
>
> No.5230-15さんの参考書で言いたい相関とは「一方が増加すれば、他方も増加する」(あるいは他方は減少する)という相関で、回帰直線(曲線)を描くような相関は想定していないと思います。t検定で十分でないのはベルシェイプとかイメージしていただければ十分かと思います。
> なお、相関係数はt分布に従うので、相関係数に有意差があるかとかはt検定になります。
> 相関係数だけで議論できない例としては、1→2→3と用量を増やしたときに反応が10→30→500みたいな場合には相関はありますが、相関係数で議論できるでしょうか? 相関係数が有意じゃないからといって、用量相関がないと言って良いでしょうか?

その場合は非線形回帰分析をするものではないかと
おもいます。

(無題) 削除/引用
No.5230-21 - 2016/07/14 (木) 21:25:15 - 通りすがり
用量反応について私も勉強中の身ですが。。。

No.5230-15さんの参考書で言いたい相関とは「一方が増加すれば、他方も増加する」(あるいは他方は減少する)という相関で、回帰直線(曲線)を描くような相関は想定していないと思います。t検定で十分でないのはベルシェイプとかイメージしていただければ十分かと思います。
なお、相関係数はt分布に従うので、相関係数に有意差があるかとかはt検定になります。
相関係数だけで議論できない例としては、1→2→3と用量を増やしたときに反応が10→30→500みたいな場合には相関はありますが、相関係数で議論できるでしょうか? 相関係数が有意じゃないからといって、用量相関がないと言って良いでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.5230-20 - 2016/07/14 (木) 09:21:06 - mbb
相関をみるなら相関係数でいいのでは
ないですか?

(無題) 削除/引用
No.5230-19 - 2016/07/14 (木) 01:08:29 - おお
じつはその傾向なんとかとか聞いたこともないんですけど。

相関があるかを評価する

T検定では相関性を評価するに至らないのではないでしょうか。もちろん多重の検定になりますのでT検定するとp値の補正が必要です。また相関性を見るのであれば各群から2群とってその間で有意差がなくても言えるのかもしれません。

で実験デザインからして、群が多すぎて多重検定で感度を稼ぐのはかなり大変です。デザインがそういうふうな検定にそもそも向いてないところも見抜けるはずです。

(無題) 削除/引用
No.5230-18 - 2016/07/13 (水) 19:21:47 - AA
私も含め、生物学を専門にされる方は、
統計が専門でない方が多いかと思いますが、
皆さんよく勉強されていて自分もいつも反省しています。
「聞いたこともない検定法だ」などと笑っているようでは
いつまでたっても学位は取れないと思ったほうがいいです。

有意水準5%というのは、95%の確率で帰無仮説を棄却できる、という意味です。
逆に言えば5%の確率で、本当は差がないのに差がある、と結論づけてしまいます。
1対の標本であれば検定は1回なのでこの誤謬は5%ですが、
多群であれば、たとえ対照vs各群だったとしても、
(1-0.95^n)の確率で偽陽性が出るわけです。
例えば5群あれば約23%の確率で偽陽性がありますので、
少なくとも1群については結論が間違っている可能性があることになります。

この問題を回避するために多重解析はそれに合わせて補正を行っています。
いろいろありますので勉強してください。
簡便なものであればボンフェローニ法のように
「有意水準を群の数で割る」というシンプル(乱暴?)なものもあります

(無題) 削除/引用
No.5230-17 - 2016/07/13 (水) 18:05:18 - AP
>ですからコントロール群に対して1つ1つの群でTテストをやればいいのでは?と思っていましたが

私も統計学に明るいわけではなく、自分の仕事に必要になったところだけ付け焼刃で勉強している程度ですが、

1. 多重検定で、二群を取り出した組合せそれぞれについてt検定していくというのはイケナイということは、どの教科書にも書いてあります。ざっくり言うと、有意水準0.05としたとしてm群に対してそれぞれt検定をするということは0.05 x mの有意水準の検定をしていることになってしまう(つまりp<0.2とかを有意としてしまう)危険性があるということらしいです。その点を補正したt検定や、TurkeyとかDunnetなどを適宜使用します。

2. コントロール群対各群の検定では各群と有意差があるかどうかはわかるけれど、doseと反応強度に相関があるかどうかはわかりません。そのなんとかという検定はそういうことなんじゃないですか。

(無題) 削除/引用
No.5230-16 - 2016/07/13 (水) 12:06:34 - R
>6つの濃度の薬剤

t検定でも多重比較の補正が必要だと思いませんか。
また、濃度依存的に産生量に変化があるか検定したいと思いませんか。

>聞いたこともないし、なぜT検定じゃいけないのか困惑してますw
笑うところではないです。

勉強してみて、傾向テストの方がt検定繰り返すより良さそうとは思いませんでしたか。

(無題) 削除/引用
No.5230-15 - 2016/07/13 (水) 10:44:12 - 横
横ですが、次の例題に関してどのような統計解析をすべきか?なのですが、

7群のマウス(各1群に10匹のマウス)に異なる6つの濃度の薬剤を群ごとに投与し、血液中のサイトカインの発現をELISAで見ます。コントロールは生理食塩水を残りの1群に与えます。

薬剤の濃度とサイトカイン産生に相関があるかを評価することを目的とします。

各群でサイトカイン量の平均値と標準偏差が出ますよね。
ですからコントロール群に対して1つ1つの群でTテストをやればいいのでは?と思っていましたが、今読んでる参考書には、「Jonckheere-Terpstraの傾向性の検定」を用いる、だそうです。。。。。聞いたこともないし、なぜT検定じゃいけないのか困惑してますw

こういうのって皆さんわかるんでしょうか。私も統計詳しくないですが、ほとんどの生物学の実験では大抵Tテストを使ってきましたが、D試対策で勉強しはじめたところなんですが。。。。。

(無題) 削除/引用
No.5230-14 - 2016/07/12 (火) 13:05:34 - まっくろん
 以前のトピックに内容の似た議論がありますね。

 ttp://kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1534

(無題) 削除/引用
No.5230-13 - 2016/07/11 (月) 13:51:39 - AP
つまり実験的レプリケートだから標準偏差をつかい、生物学的レプリケートだから標準誤差をつかうなんていう決め付けは間違っているし、標準誤差、標準偏差の意味するところを理解していないとしか思えません。

(無題) 削除/引用
No.5230-12 - 2016/07/11 (月) 13:36:32 - おお
そうですねそれぞれ意味を持っていることは確かですね。

(無題) 削除/引用
No.5230-11 - 2016/07/11 (月) 13:30:17 - AP
どちらの場合も標準偏差も標準誤差も算出できますし、それらはそれぞれちゃんと意味を持ちます。

(無題) 削除/引用
No.5230-10 - 2016/07/11 (月) 12:49:09 - おお
>[Re:9] ImageJさんは書きました :
> >> またこの時、前者からは標準偏差が、後者からは標準誤差が算出可能という理解で大丈夫でしょうか?
>
> > こんなこと言わないでしょう。ぜったいそんなこと書いてないはずだよ。
>
> あながち間違ってはいないのでは?

一回の実験で得られるデーターでみたいのはどちらかと言えば標準誤差の方じゃないかな。

(無題) 削除/引用
No.5230-9 - 2016/07/11 (月) 12:44:43 - ImageJ
>> またこの時、前者からは標準偏差が、後者からは標準誤差が算出可能という理解で大丈夫でしょうか?

> こんなこと言わないでしょう。ぜったいそんなこと書いてないはずだよ。

あながち間違ってはいないのでは?

(無題) 削除/引用
No.5230-8 - 2016/07/11 (月) 02:57:35 - 初学者
皆様、ご指摘、ご教示いただきまして、誠に有り難う御座います。

私は臨床ばかりをしており、ほとんど無知のまま今の業務に携わっております。
もう一度本を読み直してみます。また改めてご意見を伺わせていただけますと幸いに存じます。

重ねて深くお礼を申し上げます。

初学者

(無題) 削除/引用
No.5230-7 - 2016/07/10 (日) 23:26:06 - AP
> 入門本も読んだのですが、再確認の意味もあり、トピックを立てさせていただきました。

まず、ちゃんと勉強したほうがいいよ。
入門書であってもちゃんとよんだなら、


> またこの時、前者からは標準偏差が、後者からは標準誤差が算出可能という理解で大丈夫でしょうか?

こんなこと言わないでしょう。ぜったいそんなこと書いてないはずだよ。


> もう一つの質問は、データの信頼性を高めるために検体数を増やす必要がありますが、統計解析も標準偏差よりも標準誤差の方を付した方が良いと読みました。標準誤差の求め方をエクセルで行う際には、"=STDEV/SQRT(検体数)"という演算式でいいでしょうか?

小検体数の場合、正規分布でなくt分布をモデルとし、その場合自由度は検体数でなく検体数-1(N-1)jじゃないかい。

(無題) 削除/引用
No.5230-6 - 2016/07/10 (日) 14:37:39 - おお
あ、ちなみにエクセルでSTDEVやTテスト程度でバグがあったということはないです。

(無題) 削除/引用
No.5230-5 - 2016/07/10 (日) 14:35:37 - おお
>6ウェルプレート3枚分に細胞を撒き、検体数3で次回同様の実験を行うべきなのか

この操作で何がみれますか?

テクニカルレプリケートとかいろいろそういう言葉はあまり好きでないので、違う見方でいうとまず、再現性が取れることを示さないといけないですよね。たとえばいきなり最初に1枚のプレートじゃなくって3枚のプレートに蒔いて、統計処理をしたとして再現性が取れるといえますか?もちろんその状態で統計処理をしてもいいですけど、それは何を示してますか?


>統計解析も標準偏差よりも標準誤差の方を付した方が良い

それは何を示したいかという事によります。データーの分布に重きがあるときはSDです。母集団の平均値がだいたいどれくらいの値を示し得るかを表すならSEMです。余談ですが、SDはnがいくらでも基本的に同じ値になる(理屈では)けどSEMはnが増えると小さくなるので、SEMを示した場合はnを表記しておかないとSDがどれくないなのかとか他の統計値の見当がつかなくなります。SEMで示すなら、投稿した場合nの明記が求められることもあります。

>=STDEV/SQRT(検体数)
これはまあいいですけど、最近のエクセルはSTDEVSとSTDEVPだったかながあったと思う。統計のソフト使ったほうが何かといいかと思います。エクセルは統計は弱く込み入った事をするとバグがあるので、論文の投稿のときの注意として統計でエクセルを使うなって書かれてたりしていたそうですが、その頃から2、3つバージョンが上がっているので今はどうか知りません。

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