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(無題) 削除/引用 No.5258-8 - 2016/08/18 (木) 16:43:06 - コニタン 私も、神経芽細胞腫(SCCH-26・NB-1)やHUVECsを培養して、3回くらい継代して 全滅しました。 現在も検討中ですが、インキュベーターにも原因があるかもしれません。 マイコプラズマ等に汚染されている可能性はどうですか？

(無題) 削除/引用 No.5258-7 - 2016/07/21 (木) 22:55:47 - う 株化細胞なら名前を出したほうがやはいよ。

(無題) 削除/引用 No.5258-6 - 2016/07/21 (木) 22:30:11 - Yu 皆様ありがとうございます。大変参考になります。 >>ねずみんさん 継代時に播種する密度は、解凍時の半分ほどになります。 コンフルエントになったものを4〜8分の１にして継代していました。 今まではこれ以下の密度でまいても何も問題は起きていませんでした。 継代後、翌日見ると一部くっついているものが見える(ほぼ全部浮いている)ときもありましたし、 翌日時点で全て浮いているときもありました。 細胞が接着しないという問題が起きていると思っています。 -80℃に保存しておりますので弱ってしまったか、気づかないうちに温度が揚がったことがあったのかもしれません。 >>みさん 株化細胞を使っています。 >>おおさん マイコプラズマ感染は経験がなかったので考えていませんでした。 感染すると継代時に接着できなくなる現象が起こるのでしょうか。 DMSOでの分化はないはずです。 >>くぁswでfrこlp；さん トリプシン濃度は何度も確認し、×10、×1ともに試しましたがダメでした。 薄目を試そうと思い、×10試薬を100倍希釈して使用したところ十分はがれ、そして接着もしませんでした。 今まで大丈夫だったトリプシン処理でもダメージを受けるほどに弱っているということなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5258-5 - 2016/07/20 (水) 22:27:18 - くぁswでfrこlp； トリプシン処理の工程かな。そこでダメージが加わって、継代後にちょうしわるくなるのではないだろうか。トリプシン／EDTAの濃度とか間違ってないかな？市販の細胞培養用トリプシンEDTAは濃度いくつかあるでしょ。10xと1xを混同してるとかもないだろうか。トリプシンについては細胞によってはかなりsensitiveなのもある。

(無題) 削除/引用 No.5258-4 - 2016/07/20 (水) 21:21:13 - おお その血清にマイコプラズマがコンタミしてるとか。。。凍結保存液にマイコプラズマがコンタミしていたとか。。。凍結保存液のDMSOなどで分化したりして細胞の性質が変わるとか。。。

(無題) 削除/引用 No.5258-3 - 2016/07/20 (水) 16:47:21 - み 細胞の種類など情報は提示できないのですか？ 株化細胞ですか？初代培養ですか？

(無題) 削除/引用 No.5258-2 - 2016/07/20 (水) 16:27:52 - ねずみん このような問題を経験したことがないので、ご質問に対する直接の答えはありませんが、拙いアドバイスを。 継代する際の細胞密度は、ストック解凍時と比べてどのくらい低いのでしょうか。 もともと弱っている、あるいは接着しにくい細胞を薄い細胞密度で撒いて、くっついていられなくてすぐに剥がれてしまうことは考えられます。 死んでしまうというのが、一旦dishに接着してから死んでしまうのか、そもそも接着もしないまま死んでしまうのかも重要かと思います。 同一保存ロットの問題に関して：凍結保存中に温度が上がってしまったり、-80度で長期保存してたりということがありませんか？ -80度保存は-130度保存と比べると、弱る（解凍後の生存率が低くなる）印象を持っています。

継代をすると全滅してしまう接着細胞 削除/引用 No.5258-1 - 2016/07/20 (水) 11:32:49 - Yu タイトルの通りの状況で困っております。助言をいただけるとありがたいです。 接着細胞を凍結保存しているストックから解凍し、順調に増えたところで継代を行うと接着せず全滅します。 しかも、以前は同一の凍結保存ロット、培地、血清で何も問題なく実験を行ってきました。 突然不調となり困っています。 試薬の作り替え、トリプシン処理の条件見直し、他の人に継代を頼む など行い、さまざまな方法で継代した結果、 継代後に培養する培地の血清を別ロットにしたところで何とか生育しました。 血清が途中で合わなくなる、しかも凍結保存から起こして培養することは出来るのに継代すると死んでしまう、といったことになる原因は何か考えられるでしょうか。

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