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(無題) 削除/引用 No.5261-7 - 2016/07/23 (土) 15:48:26 - AP 調べてみると、そのキットの酵素はTaqで校正活性はないようですから、3'削れこみが心配されるものではなさそうですね。でも、反応後長時間の放置は何かとトラブルのもとです。 なにかPCR反応のエンハンサー試薬が付属しているようですが、それは使って、あるいは使わずにやったんでしょうか。添加の有無で結果が変わってくるかも。

(無題) 削除/引用 No.5261-6 - 2016/07/22 (金) 12:37:40 - ANO RT-PCR、One Step RT-PCR Kitではなく、RTとPCRを別々に実施することも検討した方がよいです。 たとえばサンプルの影響を受けて、実はRTは正しく反応が起きずに、コンタミしたゲノムDNA（あるいはプライマーダイマ）を増幅していまうということもありえます。

(無題) 削除/引用 No.5261-5 - 2016/07/22 (金) 06:02:23 - おお >1st PCRのサイクル数を減らすことでnested PCRの効率が上がるのですね。 いや効率の問題でなくって特異性とか過度の増幅による副産物などの問題ですけど。。。もちろん副産物とかで効率が落ちるという可能性はありますけど。

(無題) 削除/引用 No.5261-4 - 2016/07/22 (金) 00:05:30 - AP >PCR産物は4度で一時的に保存したものを1-3日後にPCRに使用しました。 特に校正活性のある酵素だと反応後放置すると3'端の削り込みが起こります。 その結果、プライマーアニーリング配列が欠失しているかもしれません。 PCR反応後、速やかにnestedPCRに進むか、精製して酵素を除いてから保存するかすべきです。

(無題) 削除/引用 No.5261-3 - 2016/07/21 (木) 23:12:11 - taka お返事ありがとうございます。 確かにそれからなんとかバンドを出そうと何度かPCRを行いましたが、なぜかバンドが出ませんでした。 配列はまだ確認していません。 nested PCR産物を精製しシークエンスに持って行こうと考えていました。 PCR産物は4度で一時的に保存したものを1-3日後にPCRに使用しました。 1st PCRのサイクル数を減らすことでnested PCRの効率が上がるのですね。 ぜひ試してみたいと考えています。

(無題) 削除/引用 No.5261-2 - 2016/07/20 (水) 21:35:42 - おお 理論的には増えるはずだけど、増えないんだから何かがおかしいはずですよ。ノンスペを拾っているとか。。。 あんまり気張ってPCR回しすぎると変な結果が出やすいので注意です、１コピーあれば一回のPCRで理想的には十分バンドが見れるんだから。 まあそれだけ少ないとあるPCRチューブにはターゲットの配列が入っていて、違うチューブにはターゲットの配列が入っていないということもありえますけど。 バンドの配列は確認されてますか？ ネストやるんだったら、初回PCRを１０ー１５サイクルにして、バンドが見えなくてもその一部を取ってネストに回すといいです。

nested PCR 削除/引用 No.5261-1 - 2016/07/20 (水) 16:21:37 - taka ある臓器からRNA抽出を行い、RT-PCR、nested PCRでウイルスゲノムの検出を行っています。PCR後はそれぞれ電気泳動を行ってバンドの有無を確認しています。 あるサンプルにおいてRT-PCR後の電気泳動結果で非常に薄いバンドが確認できました。バンドが非常に薄かったため同じprimerを用いて再度その領域を増幅しました(電気泳動によりバンドの増幅を確認）。その後そのPCR産物をTemplateとしてnested PCRを実施しました。しかしnested PCR後の電気泳動結果ではバンドは全く検出されませんでした。 1st PCR産物をそのままTemplateとしてnested PCRに用いた場合では、薄いながらも目的サイズのバンドを確認することが出来ました。 手技的な問題かもしれませんが、同じprimerで2度増幅したPCR産物はnested PCRを行う上で何か不都合な点があるのでしょうか。 RT-PCRにはQIAGENのOne Step RT-PCR Kit、nested PCRにはTAKARAのEx Taq を使用しています。1st PCR産物の同じprimerを用いた増幅にはTAKARAのEx Taqを使用しました。 長文でのご質問失礼致しました。

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