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(無題) 削除/引用 No.5274-11 - 2016/07/28 (木) 09:14:27 - SS みさん、おおさん ありがとうございます。コザックの代わりに入れておく手もやはりあるのですね。 5' UTRさん 貴重なご経験の紹介ありがとうございました。 UTRを入れる手もあるようですが、高い発現を目指す場合入れる意義はあまりなさそうですね。 みなさん、ありがとうございます。すっきりしました。

(無題) 削除/引用 No.5274-10 - 2016/07/27 (水) 21:53:29 - 5' UTR Kozakを入れて発現が弱くなった経験はありませんが、5'UTRを入れて発現が弱くなった経験は複数回あります（同じORFで、発現が強い順に　Kozak（accATG）入り、ATGからスタート、5'UTR-ATG）。 強発現を求めてベクターを構築するのであれば、元々の自然な配列にKozakコンセンサス配列が無い（あるいは弱い）遺伝子の場合は、その5’UTRを入れる意味は無い（ことが多い）ように思います。

(無題) 削除/引用 No.5274-9 - 2016/07/27 (水) 11:42:43 - おお あまり余分な5'-UTRをつけちゃうと、その部分で発現のレギュレーションがかかり実験の解釈が難しくなる場合があるのではないかと。ただし人工的なコザックを入れる代わりにATGの上流１０ベースほどを使うてはあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5274-8 - 2016/07/27 (水) 11:42:06 - み >[Re:6] SSさんは書きました : > 発現ベクターを構築するとき、5'-UTRを含めておくことはしばしばされることでしょうか？ > 私もコザックは入れる派ですが、入れない場合は必ず５’UTRを１０bpくらい含めて1st Metから翻訳させます。

(無題) 削除/引用 No.5274-7 - 2016/07/27 (水) 09:00:26 - ポスドク 私もコザックは入れる派です。だいたいCCACCをコザックに使います。 私の友人のラボではコザックを入れないようです。しかし実験はうまく行っているようです。 無いものを作って上手くいかないとコザックが無いからなんじゃないかと悩むより、通常はコザックを入れるものとして考えておいたほうが良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5274-6 - 2016/07/27 (水) 08:31:18 - SS 私もコザック入れる派です。 入れ忘れちゃったなら仕方ないけど、入れといて損はないと思うので、 これからサブクローニングするなら、入れといたらよいと思います。 横やりで恐縮ですが、教えてください。 私は発現ベクターを作るとき、例えばKozak-ATG-ORF-STOPのようにデザインすることが多いのですが、 先日、年配の同僚に5'-UTRを少し入れておいたほうが良いことがある（安心？）と助言されました。 Nativeな5'-UTRを入れておくことで、発現を助ける、安定的にできるようなことをおっしゃっていましたが、実質的にはどうなのかなと思いました。 発現ベクターを構築するとき、5'-UTRを含めておくことはしばしばされることでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5274-5 - 2016/07/26 (火) 22:46:46 - AP あっても発現しないことがあるのに、なければ勝ち目の少ない全くの運任せ。 もし発現したなら、たまたまKozak配列に相当するものがあったから。

(無題) 削除/引用 No.5274-4 - 2016/07/26 (火) 22:26:00 - おお あったほうがいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.5274-3 - 2016/07/26 (火) 16:30:01 - 中年 pcDNA3.1をベースに構築した、N末端エピトープタグを持つベクターだということはないですか。だったら、エピトープ部分の上流にコザック配列が既に入ってるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.5274-2 - 2016/07/26 (火) 16:12:24 - cc なければ発現しないというわけではないので、とりあえず発現させてみて発現量が低ければ考えてもよいと思う。 ポイントミューテーションはそんなに難しくないので、後からでも入れられます。 二度手間が惜しいということなら、上司に相談して新しいプライマーを設計しましょう。 上司がどんな人か知らないのですが、面倒な人ならそのまま進めた方がいろいろ無難。 N末融合タンパク質発現ベクターなどで無い限り、ベクターにコザック配列があることはないと思うよ。

pcDNA3.1(+)にコザック配列は必要でしょうか 削除/引用 No.5274-1 - 2016/07/26 (火) 15:48:16 - Kozak 初めてプラスミドを構築していますが、制限酵素認識配列を両端に付け、ATGからSTOP codonまでのPCRアンプリコンをプラスミド入れるのではなく、コザック配列と呼ばれる数塩基をATGの前に置く方がよい、という過去のトピックをみました。 私が上司から渡されたプライマーにはコザック配列は付いていないようで、プラスミド側にもきっとないんだと思います。 入れた方がいいでしょうか？

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