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ヒト全血由来好酸球のPCRについて トピック削除
No.5275-TOPIC - 2016/07/26 (火) 16:10:43 - ビギナー院生
　ヒト全血より好酸球を単離しmRNA化、逆転写を行いPCRにかけているのですがACTBが回らないケースがかなり多く難渋しております。
　　自分の手技に伴うものを最も考えBEAS2Bなどcell lineの細胞を用いて同様の手順で行うと特に問題なく検査自体を行うことが可能でした。


@　全血をフィコール分離しDDWでlysis
A　cell cover処理を施しMACSで好酸球を単離
　（細胞数は1×10　6乗〜1×10 5乗までいろいろと段階をふってみましたが細胞数が少ない場合はうまくいかず、多い場合はうまくいくといった傾向も認めませんでした）
B　IsogenUを用いてmRNA化 (この時点で分光光度計を用い50-100ng/μLであることを確認。同検体より最低8μL以上を使用)
C　superscriptVを用いたkitでcDNAを作成
D　taqmanプローブを使用しPCR

簡便ですが上記手順で行っており、どなたかもしアドバイスをいただけましたら幸いです。
　
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失礼いたしました 削除/引用
No.5275-9 - 2016/07/29 (金) 15:50:32 - ビギナー院生
＞emaさん
　大変失礼いたしました。以前この記事を拝読させていただいており前処理としてcell coverの処理、mRNA化にisogenを用いるようにプロトコルを変更この手技でmRNAの収量として安定してきていたと思っておりましたがPCRが回らず困っておりました、、、

(無題) 削除/引用
No.5275-8 - 2016/07/29 (金) 14:00:44 - おお
>＞おおさん
>　重ねてあり

３度目のコメントは emaさんですよ。

重ねてありがとうございました 削除/引用
No.5275-7 - 2016/07/29 (金) 09:24:01 - ビギナー院生
＞おおさん
　重ねてありがとうございました。実はこの記事を拝見しており
好酸球のperretの処理にcell coverの処理を追加したのとmRNA化
をスピンカラムからisogenに変更してたところでした。
もう少し検討してみます。

以前の好酸球のページ 削除/引用
No.5275-6 - 2016/07/28 (木) 11:35:02 - ema
非常にRNA分解しやすい細胞です。
以前の討議でありましたので参考までに。

http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2920

ありがとうございます！ 削除/引用
No.5275-5 - 2016/07/27 (水) 11:41:52 - ビギナー院生
＞おおさん
　非常に思慮の足らない質問に親切に答えていただきありがとうございました。泳動していなかったので少し確認します。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.5275-4 - 2016/07/27 (水) 11:37:49 - おお
>分光光度計で測定しているので、一応分解されていないと思う

分光光度計では分解しているかどうかわからないです。

ありがとうございます。 削除/引用
No.5275-3 - 2016/07/27 (水) 06:02:30 - ビギナー院生
＞おおさん
　ありがとうございます。培養細胞でも同じ濃度に調整し特に問題なくPCRを行うことができました。確かにmRNAが分解されていたらcDNAは合成できないですね。分光光度計で測定しているので、一応分解されていないと思うのですがいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.5275-2 - 2016/07/27 (水) 01:43:04 - おお
RNAが分解してたらかからないよ。培養細胞のときのcDNA合成のRNA量は一緒ですか？

ヒト全血由来好酸球のPCRについて 削除/引用
No.5275-1 - 2016/07/26 (火) 16:10:43 - ビギナー院生
　ヒト全血より好酸球を単離しmRNA化、逆転写を行いPCRにかけているのですがACTBが回らないケースがかなり多く難渋しております。
　　自分の手技に伴うものを最も考えBEAS2Bなどcell lineの細胞を用いて同様の手順で行うと特に問題なく検査自体を行うことが可能でした。


@　全血をフィコール分離しDDWでlysis
A　cell cover処理を施しMACSで好酸球を単離
　（細胞数は1×10　6乗〜1×10 5乗までいろいろと段階をふってみましたが細胞数が少ない場合はうまくいかず、多い場合はうまくいくといった傾向も認めませんでした）
B　IsogenUを用いてmRNA化 (この時点で分光光度計を用い50-100ng/μLであることを確認。同検体より最低8μL以上を使用)
C　superscriptVを用いたkitでcDNAを作成
D　taqmanプローブを使用しPCR

簡便ですが上記手順で行っており、どなたかもしアドバイスをいただけましたら幸いです。
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