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DNAの収量が少ない 削除/引用 No.5281-8 - 2016/07/28 (木) 23:10:05 - たいぞう エタ沈様、再びAP様、Ks様、おお様 お返事有り難うございました。 昨夜、皆様のアドバイスを読んで一人パニクっておりました。 当方の事情をお話しすれば、病院併設の小さな検査室規模で、普通は研究室にあるような試薬もありません。 故に、プラスミドも無理で(新規に導入せねばなりません）、エタ沈さえ新しい試薬を購入しなければ出来ないような有様です。 乾燥させて濃度を高くするという考えも、冷蔵庫で蓋を開けっ放しにして乾燥させるような事を考えておりましたので、自分の単純おバカ発想が情けないです・・。 とりあえず、PCRの条件を変えてみます。 それから、PCR産物でもう一度PCRをかけてみるというのもやってみます。 その上で、おお様のおっしゃるように、新しいトピを立ててお伺いしたいと思います。 有り難うございました。 またよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.5281-7 - 2016/07/28 (木) 00:52:01 - おお >濃度不足のDNAのチューブが何本もあるのですが、乾燥させて一緒にして濃度を高くする方法は駄目でしょうか？ もし同一のものが複数のチューブにあるなら、まとめて一本にして、濃縮してもいいです。スピードバック使う人もいるようですが、個人的にはエタ沈のほうがいいと思ってます。 複数バンドが出るのが通常かどうかとか、あなたの切り出したバンドが目的のものであるかどうかは、新しいトピを立ち上げて実験の過程を示して質問されたほうがよろしいかと。

(無題) 削除/引用 No.5281-6 - 2016/07/28 (木) 00:08:17 - Ks TAかTOPOクローニングで一度プラスミドにしてしまいましょう。

(無題) 削除/引用 No.5281-5 - 2016/07/27 (水) 21:49:13 - AP とりあえず考えつくことは、その精製したPCR産物を少量とってもう一度PCRをかけてみるとか

(無題) 削除/引用 No.5281-4 - 2016/07/27 (水) 21:34:26 - エタ沈 >濃度不足のDNAのチューブが何本もあるのですが、乾燥させて一緒にして濃度を高くする方法は駄目でしょうか？ エタ沈後に少量のTEにでも溶かすことで濃度を上げる手は確かにありますよ（でも、収量が低いという根本的な問題は、今後の為にも解決するべきだと思う）。 >普通、複数バンドは出ないのですか？ 普通は出ません。というか、出ないようにPCRの条件を検討します。アニーリング温度を上げるとか、テンプレートDNAの量を減らしたりとか。サイクル数も、出来れば低めで。なんでもかんでも40サイクル回す人を知っていますが、やはり、シングルバンドでビシッと決まることは無いようですね。

DNAの収量が少ない 削除/引用 No.5281-3 - 2016/07/27 (水) 20:54:41 - たいぞう AP様お返事有り難うございます！ PCRしているのだからなんぼでも増やせる・・はずなのですが、たぶん元のcDNA量が少なかったのだと思いますが、ゲル精製後は収量ががくんと落ちます。。 mRNAの抽出はDynabeaseを使っています。最近、材料とビーズの量を増やして、ようやく少し収量が上がりました。 使えなかったうす〜いDNAがもったいなくて、なんとかならないものかと思っています・・・。 質問からずれてしまいますが、 「ゲル切り出ししなければならないほど副産物が出来ていますか？」 という問いかけで、なんだか訳が分からなくなってきました。 普通、複数バンドは出ないのですか？ 私が目的バンドと思って切り出しているものは、本当に目的物なのかどうか・・・不安になってきました。 PCR後に電気泳動すると、複数のバンドが出てきます。 プライマーのプロダクトサイズ近辺には一本しかバンドが出ないので、それが目的産物だと思っていましたが、違うこともあるのでしょうか・・？ 馬鹿みたいな質問かもしれませんが、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.5281-2 - 2016/07/27 (水) 19:15:23 - AP PCRしているのだからなんぼでも増やせるでしょう？ 精製でロスしているんですか？ ゲル切り出ししなければならないほど副産物が出来ていますか？ そうでなければ、カラム精製あるいはPEG沈殿、ExoSAPでプライマーとdNTPだけ除けばシークエンスできるはず。 サービスプロバイダは安全をみてかなり過剰の鋳型量をデフォルトにしていますが、実際はかなり少なくても可能なスペックがあるはず。プロバイダも標準的でない鋳型量については応談してくれると思います。

DNAの収量が少ない 削除/引用 No.5281-1 - 2016/07/27 (水) 18:58:33 - たいぞう いつもお世話になります。 超初心者です。 mRNA抽出から、あらゆる段階でキットを使ってPCRまで行い、目的バンドを切り出してゲル精製し、いよいよシーケンスに・・・と言う段階で、シーケンスに出すには外注先が指定してくる濃度に足りません。 濃度不足のDNAのチューブが何本もあるのですが、乾燥させて一緒にして濃度を高くする方法は駄目でしょうか？ ほかに濃度を高くする方法はありますでしょうか？ ご教授いただけると助かります。 どうぞよろしくお願いいたします。

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