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(無題) 削除/引用 No.534-18 - 2012/05/20 (日) 19:26:59 - 可逆反応 ちょっと手厳しかったかもしれませんが、今度はＥＬＩＳＡの情報が抜けてますよ（笑い）。 その議論をしたいのなら、Scatchard analysis が一般的に行われると思います。 Scatchard analysis http://www2.uah.es/farmamol/Public/pharmacol_guide/chap3b.html 普通は、放射性標識したリガンドを用いますが、蛍光標識でも状況によってはできるような気がします。 レセプター側の立体構造を変える生理的処理があると厳密なのですけどね。 ＞｢同じmoleculeを認識するモノクロならsignal ratioが同じになるはず｣ ２つのモノクロの親和性Ｋｄが同一かどうかによって、答えは変わってくるでしょう。 その情報はないようなので（ELISAのみで少々あるだけ、ＦＣではない）、答えは分からないが正解かと思います。 ＦＣは鋭敏なので、同じ処理サンプルでも違ってくることがあるので（すでに指摘されている）、有意さがあるかどうかはいくつもやって統計処理が必要でしょう。 （個人的には、上の親和性Ｋｄが違えば、同じにならないことがほとんどだと思います。） しっぽだけ見せて、白猫か黒猫か判断したいと言っても、無理なんじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.534-17 - 2012/05/20 (日) 11:37:19 - Ueno 学部生以下とは手厳しいですね。こういった場はなかなか難しいです。 そのmoleculeが立体的にvariableかどうかの情報は一切ありません。強制発現なのでそもそも正しいconformationなのかも定かではありません。分かっているのは以下の三点のみ。 1 あるmoleculeのある部分を免疫原としてマウスに免疫。 2 hybridoma群からELISAトップスコアの2つをpick up。 3 moleculeを発現させた細胞に対するFCで、2つの抗体のsignal ratioが異なる(発現させていない細胞に対するFCでは、抗体もcontrolもsignalは同じ)。 この三点から上の人の解釈として、｢同じmoleculeを認識するモノクロならsignal ratioが同じになるはず｣だから、｢moleculeが立体的にvariableで、それぞれの抗体が認識できるfoldingとそうでないfoldingが混在している｣としています。 自分が疑問に思ったのは前提となっている、｢同じmoleculeを認識するモノクロならsignal ratioが同じになるはず｣という事柄のみです。上の人の方向性はそれをクリアにしてから考えます。よってそれ以外の情報は言いませんでした。 様々な回答ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.534-16 - 2012/05/20 (日) 03:00:33 - u 上の方はどこに向かって進んでいくつもりなのでしょうか？ある分子に２つのコンフォメーションがあるはずで、それを明らかにしていくのでしょうか？別な角度からの検証方法もいくつか考えられるはずなので、一つの方法に固執せずイロイロやってみてはいかがでしょうか（ある意味のしつこさは研究者として重要なのかもしれませんが。）？ あと、脱線かもしれませんが、どこかでウエスタンの話がありましたが、ウエスタンと免疫染色で使える抗体が違うと言う話は良く聞くので、あまり参考にならないかもしれませんね。 library.ibp.ac.cn/html/slwj/000260424000003.pdf

(無題) 削除/引用 No.534-15 - 2012/05/19 (土) 23:09:44 - Q はい、迷宮入り。 この分だと、Uenoさんはコメンテーターが言っていることの真意も理解していない可能性あり。質問に答える時間が無駄な気がする。

(無題) 削除/引用 No.534-14 - 2012/05/19 (土) 09:24:00 - 可逆反応 あのー、Uenoさんね。そういうことは、小出しにしないで、最初に分かりにくいといわれた時点ではっきりと説明しないとだめですよ。 サイエンスの議論に慣れていない、学部生以下ですよ。

(無題) 削除/引用 No.534-13 - 2012/05/19 (土) 08:45:59 - Ueno 皆様ありがとうございます。じっくりと考えて見ます。 もう少しbackgroundを説明すると、コメンテーターの主張は、signal ratioが同じになるはずだから、同じになっていないこのflow cytometry dataから、target moleculeが立体的にvariableで、それぞれの抗体が認識できるfoldingとそうでないfoldingが混在しているということです。かなり強く断定しておりました。

iso-type 削除/引用 No.534-12 - 2012/05/18 (金) 20:46:57 - Flow-Joe 抗体を精製したことがある方なら分かると思いますが、同じ動物種の同じアイソタイプでも糖修飾に差があるために分子量に差があることが多々あります。つまりは、標識に差が出ることも有り得ると思います。Avidityが同じという仮定の下でも差が発生する余地はあります。 同じアイソタイプで同じ分子を認識するモノクロならシフトが同じになるというのは、実験計画の際に都合良く考えた結果であり、実験的証拠がなければミスリーディングな思い込みだと言うのが私の印象です。 ポジティブのポピュレーションがシングルピークである場合、エピトープ間で差が出ると言いたいのなら二重染色して比を出さないと駄目です。また、シフト前後の細胞をミックスして実験手技に問題が無いか確認する必要があります。双方の抗体でピークの数が異なるのであれば、お互いのどのピークが対応しているか実験的に証明できればそれでも大丈夫でしょう。 そもそも同じになるって人は何を考えているのでしょうか。 同じなろうがなるまいが、やってみればわかる話であり全く意味がない。 この質問の問題点は、実験計画としてコントロールがとれるかどうかな気がします。

訂正 削除/引用 No.534-11 - 2012/05/18 (金) 17:53:48 - 可逆反応 誤＞該当する2抗体でウエスタンのシグナルに明らかな違いがあるような一般例では（１）が正解になると思います。 正＞該当する2抗体でウエスタンのシグナルに明らかな違いがあるような一般例では（１）が間違いというのが正解になると思います。

(無題) 削除/引用 No.534-10 - 2012/05/18 (金) 17:52:30 - う よくわからないのですが、 同じタンパク質の違う領域を認識する抗体が２つあって、 かつ、その抗体のアフィニティーは完全に同じであっても 蛍光物質ということだけに焦点をあてて述べると、 素朴な、素朴な疑問が生じると思います。 ラベルされた蛍光物質は、製品のバッチ差、 メーカーの差、保存状態の差、そもそもの蛍光物質の違い があって、それによってシグナル強度は変わるんじゃないのかと。 なにを難しく考えているのかと思うと同時に、 質問者様の疑問には、ちょっとずれているなと思うと同時に、 その「シフトは同じになる」といった人も、 「120%同じになる」とは言ってなくて、 大体同じになるはずだと言っていて、 ではなぜ、「シフトは同じになる」と言ったのかというと、 質問者様の結果があまりにも変であったので「？」と思ったから 誇張した感じで「同じになるはず」と言ったのではないかと思うと同時に、 質問者様も、仮に強い口調で言われたとしても 「120%同じになるなんてないよな」くらい 軽く流しておけばいいことではなかったのかと、 個人的に思います。

(無題) 削除/引用 No.534-9 - 2012/05/18 (金) 17:50:29 - 可逆反応 ＞先日、同じ細胞の同じtargetに対するflow cytometryなら、抗体が違ってもシグナルシフトは同じになるはずだといわれました。抗体は一度くっついたら離れないから、プラトーに達していたならシフトは同じになる、ということを根拠としてあげられてました。（１） ＞もし使っている抗体がともにvery-slow dissociatingで、bindingの時間を十分に取ったと仮定したならば、理論的にはsignal ratioは同じになるということでしょうか？　（２） それは、最初の質問と次の仮定に重大な矛盾がありますよ。 結合定数、解離定数が（１）では一般的に違う話なのに、（２）ではほぼ同じとすると「再仮定」しています。これは定量的な話なので、該当する2抗体でＦＣで違いが出るかどうかはやってみないと分からない、というのが正解でしょう。 該当する2抗体でウエスタンのシグナルに明らかな違いがあるような一般例では（１）が正解になると思います。

(無題) 削除/引用 No.534-8 - 2012/05/18 (金) 14:11:28 - FlowJoe そもそも、その議論の意義は？ 二つの抗体で染めてratioで判断しないと結局は間接的なデータでエピトープの領域の変化は言うのは難しいと思いますが。

ほぼ同じ 削除/引用 No.534-7 - 2012/05/18 (金) 12:35:49 - ss > 同じmoleculeに対して、違うepitopeを認識する抗体2つ(ともにmIgG1)を過剰量使ってflow cytometryをやった場合、control mIgG1からのシグナルのシフト(signal ratio)が同じになると主張しています。二次抗体は同じものを使い、抗体incubationの前後はwashをしています。 > > もし使っている抗体がともにvery-slow dissociatingで、bindingの時間を十分に取ったと仮定したならば、理論的にはsignal ratioは同じになるということでしょうか？ この場合、あなたの上司の主張が「ほぼ」正しいでしょう。 抗原に対して過剰量の抗体で染色していて、その２つの抗体がともにvery-slow dissociatingであって速度論的に解析の間（FACSであれば長くても数時間でしょう）見た目でわかるほど外れないのであれば、少なくともFACSでのlogスケール表示の蛍光強度は「ほぼ」同じになるでしょう。 「ほぼ」と言ったのは、ほかの方が書いていらしゃるように、生化学的な平衡を考慮に入れた場合、その２つの抗体の結合定数が少しでも違いがあれば、very-slow dissociatingな抗体と言えど解離した抗体の数に差が出てくるはずです。 しかし、FACS解析のように細胞数が相当数あり抗原数も絶対的に多い場合、そのような解離は蛍光強度のLogスケールで見て分かるほどのものではありません。 よって、FACSのデータを解釈するにあたっての判断としては、上司の主張が正しいでしょう。 見た目に現れない生化学的な分子論を持ち出すのであれば、間違いとも言えますが、この場合そのような議論は無意味です。 もしあなたのデータで２つの抗体染色に蛍光強度の違いが明らかに見てとれるのであれば、一方の抗体のアフィニティーが弱いなどの原因があると思われます。 上司の主張が頑なと言われてますが、FACS解析を一般的に考えれば普通の主張です。 数時間で外れるような低アフィニティー抗体は、そもそも抗原の発現量を比較するような実験系には適していないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.534-6 - 2012/05/18 (金) 11:00:16 - Ueno 言葉足らずですいません。 同じmoleculeに対して、違うepitopeを認識する抗体2つ(ともにmIgG1)を過剰量使ってflow cytometryをやった場合、control mIgG1からのシグナルのシフト(signal ratio)が同じになると主張しています。二次抗体は同じものを使い、抗体incubationの前後はwashをしています。 もし使っている抗体がともにvery-slow dissociatingで、bindingの時間を十分に取ったと仮定したならば、理論的にはsignal ratioは同じになるということでしょうか？ 上の人が頑強に主張されるので、はっきりと間違っているとは言いづらい状況です。理論的にはそういうケースは有り得ますが、、、という感じで説得できないかと考えています。

(無題) 削除/引用 No.534-5 - 2012/05/18 (金) 07:12:14 - 可逆反応 抗原抗体反応は、言うまでもなく、平衡定数をもった可逆反応です。 抗原に対する親和性の高い抗体もあれば、低いものもあります。 シフトというのは、ＦＣのシグナル強度と解釈できますが、抗原に対する親和性のより高い抗体は、当然、よりシグナル強度が高くなります。 その反応時間は、実践的な範囲（たとえば１−24ｈ）では、抗原に対する親和性のより高い抗体は、当然、よりシグナル強度が高くなります。 たとえば、この時間を48-72ｈとしても、抗原に対する親和性のより高い抗体は、よりシグナル強度が高くなると思います（たとえばウエスタンから推測、親和性の低い抗体はいくら時間を長くしてもダメ）。すなわちその質問者さんのコメンテーターの言うことは、基本的に間違いといえるでしょう。 たとえば１ｈと24ｈの反応時間で、実験的にそれを証明できるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.534-4 - 2012/05/17 (木) 19:51:20 - qq >Biacoreで見ているdissociationはなんなんでしょうか？ 親和性の低い抗体しかbiacoreで見ていないとか？、ありそうだと思うのですがいかがでしょう？モノクロでは、比較的低親和性の抗体がよくとれます。 biacoreで見るためには、fast-binding、fast-dissociationであることが必要だと思うのですがどうでしょうか？ 多くの抗体は、slow-binding, very-slow dissociatingだと思っています。実験の操作時間に比べて十分に”very-slow dissociating”だと、不可逆的に結合していると呼びます。

最近はリンクが貼れない？ 削除/引用 No.534-3 - 2012/05/17 (木) 17:44:37 - ~ ELISAの原理等を見ると分かりますが、可逆反応であることを計算に入れていますね。 >シグナルシフトは同じ これは何が同じことを意味しているのでしょうか？ 通常であれば、シフト自体が逆転することはないでしょう。 ratioまで同じかどうかや、シグナルの絶対値まで同じかどうかは、抗体次第でしょう。 (絶対値については、日が違えば同じ抗体でも異なることもありますが)

(無題) 削除/引用 No.534-2 - 2012/05/17 (木) 17:13:51 - 通りがかり 漠然とした質問というより、内容で今イチ理解できないことがあります。 同じtargetとは、同じタンパク質の同じエピトープというところまでを指すのでしょうか？ 抗体が違ってもとは、抗体の標識も異なるということまで含んでいるのでしょうか？ どこまでが同じで、どこまでが違うのか、 同じという言葉をどこの範囲まで適用させているのか 違うという言葉をどこの範囲まで適用させているのか よくわかりません。 わかったところだけ回答しますが、 ＞抗体は一度くっついたら離れないのでしょうか？ くっついたり離れたりすると思います。 でも、それはどの抗体も同じような割合でくっついたり離れたりするので 結局、どっちにしても同じような感じで「結合する」ことになると思います。

同じtargetに対するflow cytometryのシフト 削除/引用 No.534-1 - 2012/05/17 (木) 16:19:09 - Ueno 先日、同じ細胞の同じtargetに対するflow cytometryなら、抗体が違ってもシグナルシフトは同じになるはずだといわれました。抗体は一度くっついたら離れないから、プラトーに達していたならシフトは同じになる、ということを根拠としてあげられてました。 しかし、いまいち納得できません。それが本当なら、specific bindingという過程のもとで、同じtargetを検出するWB、IHCのシグナルも抗体間で変わらないということにならないでしょうか？本当に、抗体は一度くっついたら離れないのでしょうか？Biacoreで見ているdissociationはなんなんでしょうか？ 漠然とした質問で申し訳ありませんが、よろしくお願いします。

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