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脱グリコシル化に掛かる時間 削除/引用 No.5342-5 - 2016/08/19 (金) 21:51:38 - グリコ初心者 皆様、コメントありがとうございます >[Re:4] くぁswでfrgthyじゅさんは書きました : > 基質側の糖蛋白質について調べる上でその結果から得られる情報はとりたててないように思うのですがどうでしょうか。 仰る通りと思います。簡単に出るなら確認実験の時にやろうと思ったのですが、案外面倒そう（5分でも完全にシフトしてました）なのでタイムコースはやらないことにしました。 > どちらでもOKの酵素の場合だと、だいたい、変性時の時間の2~4倍くらいかけるのではないでしょうか。 変性条件、未変性条件どちらも試したのですが、どちらでも5分でシフトが見られましたので、タンパクXはよっぽど脱グリコシル化酵素（のどれか）にとってアクセスしやすいのかな？などと想像しています。 >O-glucNacの酵素による除去にはたしか数日間インキュベート そんな場合もあるんですね。「酵素」反応でそんなにかかるって、実際の生体内でもそんなことあるんでしょうかね？面白いです。 >[Re:3] totoさんは書きました : > 都市伝説のような気がします。NEBのPNGaseの反応は早いです。意外な感じがいつもしますが、タンパクが完全に変性されるからでしょう。データがすべてです。 やはり早い場合もある、ということですね。 最初の実験は全部入り（というと語弊がありますが）のDeglycosylation Mixでやったのですが、これからPNGase単体を試してみます。これでシフトが見られれば、変異を入れる場所がかなり限られるので続きが楽になるのですが。 >[Re:2] おおさんは書きました : > ３０ー６０分ぐらいのインキュベーションだったと思う。 30分位でシフトが見られる場合がちゃんとある、という情報はありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.5342-4 - 2016/08/19 (金) 18:46:18 - くぁswでfrgthyじゅ 脱グリコシル化の過程をタイムコースで見るのは、切る酵素の方を研究対象としているならば意味があると思いますが、基質側の糖蛋白質について調べる上でその結果から得られる情報はとりたててないように思うのですがどうでしょうか。 matureな蛋白質の場合、グリコシダーゼによる糖鎖の切断効率はしばしば付加している蛋白質の高次構造の影響を強く受けるので、変性条件下で行うことが多いですが、酵素がその条件に耐性がなければ、未変性条件でやらざるを得ません。この場合は確かに切れにくいです。どちらでもOKの酵素の場合だと、だいたい、変性時の時間の2~4倍くらいかけるのではないでしょうか。NEBは確か未変性の時の反応条件も書いてあったように思います。酵素量も増やした方がいいのかもしれません。O-glucNacの酵素による除去にはたしか数日間インキュベートしたとなにかの論文でみて、長いなーと思った記憶があります。

(無題) 削除/引用 No.5342-3 - 2016/08/19 (金) 13:07:48 - toto 確かに脱糖鎖反応が遅いという印象はなんとなくありますが、これはタンパク側の構造が酵素のアクセスを妨げるからと、古典的なエンドグリコシダーゼHの反応の遅さからイメージされる都市伝説のような気がします。NEBのPNGaseの反応は早いです。意外な感じがいつもしますが、タンパクが完全に変性されるからでしょう。データがすべてです。

(無題) 削除/引用 No.5342-2 - 2016/08/19 (金) 10:35:49 - おお そんなの基質の濃度とか酵素の濃度とか酵素のそのターゲットに対するアフィニティーとか色々あるのに簡単に答えたとしても参考にならないですけど、昔IPしたサンプルを処理すると使った抗体のバンドがきちっとシフトしてた。３０ー６０分ぐらいのインキュベーションだったと思う。

脱グリコシル化に掛かる時間 削除/引用 No.5342-1 - 2016/08/19 (金) 09:44:58 - グリコ初心者 脱グリコシル化実験の経験がある方、脱グリコシル化反応にどれ位の時間がかかったか教えていただけますか？ 研究対象のタンパクXが通常グリコシル化されていることを証明しようとしています。 cell lysateに対してNEBの脱グリコシル化酵素ミックスを加えて反応させたものと加えなかったものを用意して、SDS-PAGE、ウェスタンブロットを行いました。加えたものは、加えなかったものより20 kDa程小さくなり、計算上予測されている分子量位のところにバンドがシフトしました。タンパクXがグリコシル化されることは間違いないと思います。 これから、予測されているグリコシル化サイトを変異するなりしてきちんと証明する予定なのですが、それ以外に、簡単に、脱グリコシル化反応のタイムコースを取って、シフトしたバンドが徐々に増加していく（一方で、元のバンドは徐々に減少していく）という図を作ったらどうかと言われました。 早速タイムコースを取ってみたのですが、シフトは反応15分で見られ、元のバンドはその時点で完全に無くなっていました。 脱グリコシル化は時間が掛かることが多いとどこかで聞いたのです（O/Nで反応させたりとか）が、タンパクXは随分簡単に脱グリコシル化するようで、あまりに早すぎて、なにかどこかで勘違いでもしているのではと心配になってきました。 論文で1時間で完全に反応しているのは見たことがありますが、もっと短い時間で、という経験をされた方おられますか？

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