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(無題) 削除/引用 No.5386-11 - 2016/09/08 (木) 02:23:13 - おお フィルム使うと直線性があるところに持っていくのも難しいですからね。サンプルの希釈だけでは他の夾雑物のレベルも下がるのでそういうもの由来のバックグランドの評価ができませんよね。 ネガコンを使って出てないらしいので、ネガコンで希釈すればいいかもしれませんが、そもそもネガコンで出てないので希釈する必要もないとも言えます。また定量でなくてもいいなら直線に乗る必要はないですし。

(無題) 削除/引用 No.5386-10 - 2016/09/07 (水) 11:13:40 - えー 既知のサンプルの希釈系列で検量線かければいいんじゃないの？ 逆に検量線かけないならコントロールがあっても信用できない。

(無題) 削除/引用 No.5386-9 - 2016/09/04 (日) 04:17:41 - おお 商品の謳い文句として数時間維持できるとか書いてある物もあります。条件次第なんだと思いますが大抵の場合は１時間とかでかなりシグナルが弱くはなってきてます。最近のGEのなんだっけプライムとかだっけ、あれはどんな感じですかね？

(無題) 削除/引用 No.5386-8 - 2016/09/04 (日) 00:13:36 - み >[Re:1] westernさんは書きました : > > 具体的にover exposureとはover nightでexposeしています。 > > 私の経験上、抗体や抗原、検出試薬の感度にも依ると思うんです。 > 皆さんが指摘しているようにｹﾐﾙﾐで一晩も効果が時間依存的に保たれるものは本当にあるのかな？と想っている。販売会社の謳い文句として24時間持続とか見たことある気はするけど個人的には信じていない。 たぶんボスも同じような印象なのでは？ あなたの実験系は大丈夫ですか？って感じ。 あなたが仰るように抗原抗体、検出試薬に依るのは当然だし、それが分かっているなら検出試薬の種類を変更して1時間で綺麗なバンドを出す努力くらいすれば良いのに。 分画や免疫沈降などで抗原を濃縮するなどの工夫は適用できない実験かな？

(無題) 削除/引用 No.5386-7 - 2016/09/03 (土) 22:34:05 - 中年 トピ主さんのいう"over exposure"とはどういう意味ですか？単に"非常に長時間exposureする"という意味でお使いのように読めるのですが。回答のいくつかは、飽和して直線性が失われるレンジまでexposureされているという用法（こちらの方が一般的）を前提としていますよね。

(無題) 削除/引用 No.5386-6 - 2016/09/03 (土) 21:16:15 - PK 「over exposureとはover nightでexpose」とありますが、これは、バンドの強さとは無関係に、単に何時間exposeしたかで定義されているという事でしょうか？　皆さんおっしゃっているように、ウエスタンの場合、２時間と２４時間で大した差があるとは思いませんが、２４時間exposeしても陽性サンプルのバンドが飽和していないならば、それでも良いように思いますし、５分でもバンドが飽和していれば、条件をかえてやり直した方がいいでしょう。個人的には、over exposureと言う時は、露光時間ではなく、バンドの強さで判断しています。

(無題) 削除/引用 No.5386-5 - 2016/09/03 (土) 19:08:21 - asan ウエスタンでO/Nでエキスポーズってちょっと尋常じゃない気がするんですが、そういわれたらちょっとだいじょうぶかなあ？とは思いますけどね。O/Nなんて弱いRIでオートラする時ぐらいじゃないだろうかと思ったが？ ポジコンネガコンが動いてて定性的な議論ならもちろん結果としてはありかもしれませんが、そもそもECLなんかはサチレーションしてないという前提で視覚的にみせるものですから、明らかにのせ過ぎだったりしたら心証が悪くなるのは意見としてはないわけでもないとは思います。ポジコンネガコンは所詮違うサンプルですし、あくまで参考程度にしかなりませんから、明らかにサチってるともしかしたら予想外のアーティファクトを見逃してしまうことだって今後の実験でもあるだろうという考えも出来ますよね。 いずれにせよ、そういうのを結果が良ければいいと適当にやって期待通りの結果がでればよしとする雑なのを嫌う研究者は（特に日本人は）いますから、そのボスがそういうタイプだとするならばボスの言った通りやり直すぐらいはありかなあと思いますけど。メンブレンを染色し直すなら数時間で終わる話ですし。

(無題) 削除/引用 No.5386-4 - 2016/09/03 (土) 18:09:43 - AP HRP/ルミノール系の検出試薬でo/nの露光が有効なものはごく限られた製品しかなくて、それもo/n露光が効果的だったというほどの経験はないです。HRPは反応開始するやどんどん失活していくものですから。どのブランドの試薬を使っているのでしょうか。ひょっとすると本当はo/n露光したものの反応はもっと前で止まっているんじゃないでしょうか。もう少し常識的な露光時間でやってみて同じように検出できていたらボスも納得じゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.5386-3 - 2016/09/03 (土) 16:56:26 - １qw２え３r５y７う８い９お０p ECLですか、それともRI標識抗体やRI標識protein Aなどを用いたオートラジオグラフィーですか？ 検出試薬という言葉があるのでとりあえずECLとして書きます。ECLでO/Nというのは自分自身の経験でもないですし、周囲をみてもあまり見聞きしないです。ECL自体通常は数秒〜数分でシグナルが出るもので、O/Nのようなそうした使い方を想定していないと思うし。存在量が極めて少ない蛋白質ならば、そういうことも必要なのかもしれないですが、そう頻繁にそういった難しい蛋白質に出会うこともないように思うので、そうしないとシグナルが出ないことがしばしばあるならば、基本的な手技や、実験の方法（蛋白質濃度の定量および濃度換算、アプライ量の計算など。）、抗体および検出試薬の不具合、最初の実験のデザインなどに系統的な問題があるような気がします。 もちろん、どのような方法だろうと正しい結果が得られればOKと思いますが、あまり無理矢理に出したデータをもとにして次の研究計画に進むのも先々不安だとおもうので、蛋白質試料の準備からwesternまでの全過程について、このやりかたでほんとに大丈夫か、どこか間違いはないかなど冷静に検討したほうがよいとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.5386-2 - 2016/09/03 (土) 13:07:26 - おお ケミルミの試薬にもよりますが、一時間もすればかなり発光が弱くなってきてますから、最初の数十分と、そのあとのO/NのExposureでバンドので方があまり変わらなかったりします。なので、一時間でもOverだと言われるかどうかわかりませんが、 １、２時間で開けてフィルム焼いてみてはどうですか？ まあO/Nで心配という心境はたしかにわかりますけど、私は実際やることはありますね。

ウエスタンのoverexposureを信じないボス 削除/引用 No.5386-1 - 2016/09/03 (土) 12:41:07 - western お世話様です。 NIH留学中のwestenともうします。 私のボスはwesternの結果をover exposureでフィルムに焼き付けたデータを出すと、over exposureというだけでデータを信用してもらえません。 over exposureでもきちんとポジコン、ネガコンはうまく機能しており、非常に明瞭な差をだせています。具体的にover exposureとはover nightでexposeしています。 私の経験上、抗体や抗原、検出試薬の感度にも依ると思うんです。 私はたとえover exposureでも綺麗に実験がうまくいっていればいいと思っています。 が、ボスはover exposureだから、とより検出感度がよくなる工夫をしなさい、と本来の趣旨とはことなるところで労力を使わなければならないかもしれません。 困ったもんです。

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