BioTechnicalフォーラム [ELISAのバックのばらつきで困っています。]

ELISAのバックのばらつきで困っています。

No.5399-TOPIC - 2016/09/12 (月) 12:09:40 - のーりー

血清中の自己抗体の測定をするためにdirectELISAの系を立ち上げておりますが、
サンプル間でバックグラウンド(Bo)のばらつきが大きく、困っています。

手順としては
・抗原を段階希釈してプレートに炭酸バッファで固定
・ブロッキング（スキムミルク・BSA・カゼインをPBSに溶かしたもの）
・血清と反応 (10/100倍と希釈バッファ（PBS/ブロッキング液））
・洗い（PBS/PBST)
・POD-二次抗体（PBS/ブロッキング液で1000倍希釈）
・洗い（PBS/PBST）
・TMBで発色、塩酸で停止

これまでに分かっていることとして
・特定メーカーの96wellプレートでバックが高い
・ブロッキングはスキムミルク・BSAが低くカゼインは高い
・血清および二次抗体をブロッキング液で希釈した方がバックが低い
・洗いはPBSTの方が多少よいかんじだが大差なし

血清の前処理が効果的だと思うのですが、
サンプル量が多くないのでできたら避けたいです
（それでもやり方あるなら教えて欲しいのですが）。
また、バックグラウンドがばらつくため、
どういうデータを取るべきか（B-BoかB/Boか）も悩んでいます
（やりたいのは各サンプル間の比較なのですが）。
血清のバックのばらつきを解消した経験のある方がおられましたら
是非ご教授ください。よろしくお願いします。
　

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No.5399-10 - 2016/09/13 (火) 19:43:27 - ANO

ELISAではよくある話で、サンプル中の何らかのタンパクによる現象です。

抗体を変える、ビオチン標識タンパクを使った競合法EIA、あるいは、サンドイッチEIAなど別の系にするなどを試みる必要があります。

あるいは、EIAではなくラジオアイソトープを使ったRIAにするというのも手です。

こういうことがあるから、今でも、EIAよりもRIAを好む研究者が沢山います。

ELISAのバックのばらつきで困っています。

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No.5399-9 - 2016/09/13 (火) 17:15:01 - のーりー

monさん、ご回答ありがとうございます。
リンク見に行きました。バックグラウンドを減らす話は参考になります。
しかしやはり、バックグラウンドのばらつきを平らかにするとなると、
血清自体の前処理とかの方がいいのかなと感じました
（とはいえ、あさんが書いてくれている、
サンプルによって含まれる非特異的結合をする抗体量がばらついているなら
それでは解消できない話なのですが・・・）。そうなると、、、
ばらつきを解消できずとも、なるべくB-Boが大きくなるような条件を
もうしばらく探してみたいとは思っています。

(無題)

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No.5399-8 - 2016/09/13 (火) 13:19:46 - mon

いくつか記事がありました。
http://www.biocompare.com/Bench-Tips/122704-Tips-for-Reducing-ELISA-Background/
http://www.elisa-antibody.com/elisa-troubleshooting/elisa-high-background

ELISAのバックのばらつきで困っています。

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No.5399-7 - 2016/09/13 (火) 12:59:21 - のーりー

質問主です。あさん・たていすさん、とても素早いご回答ありがとうございます。

・確かにサンプル間で非特異的吸着のゲタが違うというかんじです。
　プレート・ブロッキング剤の違いによりゲタの高さが変わるのですが、
　抗原あり・なしの差が最も出るものを選んでおけば、というかんじですかね。
　とりあえずBSAかスキムミルクは決まったので、
　プレート選定もう少しやってみようとは思っています。ファルコンダメだー

・１サンプル内ならB/Bo、サンプル間ならB-Boかなとは思っていたのですが
　引き算だとバックのばらつきが考慮されないので
　それを反映すべきかどうか、判断つきかねていました。
　ありがとうございました。

・８連ピペットでちまちまアプライしております（笑
　抗原量(max/なし)を横方向に並べて振り、アプライ・洗いを縦一列などで
　10回近く色々試していますが、バックが高いサンプルは常時高いかんじなので
　アプライ・洗いがばらついているのではないと考えています。
　ばらつくELISA系の横で別の系を同プレートで流しても、とてもキレイに行きますし。
　とはいえ、過信は厳禁ですよね（笑

(無題)

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No.5399-6 - 2016/09/13 (火) 12:16:25 - たていす

> ・具体的な値ですが、抗原max (B)のときと抗原なし(Bo)のときは各々
> 　サンプル１：2.167/0.614
> 　サンプル２：0.726/0.165
> 　のようなかんじで、
ELISA洗浄機を使っているのかもしれませんが、プレートの洗い方の問題ではないでしょうか？
例えば、フナコシのウェブページにELISAキット洗浄操作動画があります。

(無題)

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No.5399-5 - 2016/09/13 (火) 11:40:37 - あ

> ・具体的な値ですが、抗原max (B)のときと抗原なし(Bo)のときは各々
> 　サンプル１：2.167/0.614
> 　サンプル２：0.726/0.165
> 　のようなかんじで、
> 　サンプル１のBoとサンプル２のBがほぼ同じだったりするほどの
> 　ばらつき方をしています。
確かにバック高いですね。ただ、サンプル１Boと２Bは別サンプルなので比べる必要があまりないように感じます。原因は分かりませんが、サンプル１の方が非特異的に結合する抗体が多く含まれているだけかと。

> 　こういうサンプル間の値を比較する場合、
> 　B-BoがいいのかB/Boがいいのか、そこも教えて頂きたいのです。
抗体価ではなく吸光度の比較であればB-Boで良いかと思います。

ELISAのバックのばらつきで困っています。

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No.5399-4 - 2016/09/13 (火) 09:35:46 - のーりー

質問主です。monさん・あさん、早々のご回答ありがとうございます。

・ブロッキング剤を混ぜるという話は初めて聞きました。
　結構、目から鱗です。ただ、すべてのサンプルのバックが高いわけでなく、
　ほとんど出ない低いものもあって、全体的なブロッキングの問題というより
　個々の血清サンプルのばらつき・高いバックを如何に下げるか、なので
　これでいいのかなという気もしています。

・バックグラウンドは抗原なしの状態です。
　血清の希釈によって、バックがリニアに下がりますが、
　抗原maxのときの値も下がってしまうので
　なんとかバックだけ下げたい（ばらつきをなくしたい）なと思っています。

・具体的な値ですが、抗原max (B)のときと抗原なし(Bo)のときは各々
　サンプル１：2.167/0.614
　サンプル２：0.726/0.165
　のようなかんじで、
　サンプル１のBoとサンプル２のBがほぼ同じだったりするほどの
　ばらつき方をしています。
　こういうサンプル間の値を比較する場合、
　B-BoがいいのかB/Boがいいのか、そこも教えて頂きたいのです。

よろしくお願いします。

(無題)

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No.5399-3 - 2016/09/13 (火) 00:57:07 - あ

バックを抑えるにはとりあえず洗いの回数を増やしたり、固相化後にも洗いをしてみてはどうでしょうか。
質問ですが、バックの設定ですが血清無しのウェルで合っていますか。
また吸光度としてどの程度バラつきがあるのでしょうか。

(無題)

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No.5399-2 - 2016/09/12 (月) 20:03:08 - mon

効果がないときもありますが、、
(1)ブロッキング剤を２種（複数）混合する（濃すぎても良くない）。
似たような効果で、標識抗体の希釈液にウェルのブロッキング剤とは異なるブロッキング剤を添加する（通常濃度の1/100-1/50で良い）。
(2)ブロッキング液をwellに目一杯入れる（shakeして縁まで液が上るようにする）。

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No.5399-1 - 2016/09/12 (月) 12:09:40 - のーりー

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