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(無題) 削除/引用 No.5402-13 - 2016/09/22 (木) 14:10:27 - みるきー 今までのプロトコルではテンプレートを制限酵素で直鎖化してIVTを行っていましたが、テンプレートプラスミドをIVTに必要なプロモーターを挟むようにPCRで増幅してゲル抽・精製し、それをテンプレートとしてIVTを行ったところ、アガロースゲルでもシングルバンドが確認できました。 ゲル抽産物はシークエンスで読んでインサートとプロモーターの配列が確認できたのでIVTの産物も目的の配列であると考えられます。 念のため、ドットブロットで力価を調べようと思います。 皆さま、たくさんのご助言ありがとうございました。 お陰様でin situ hybridizationまで辿り着けそうです。

(無題) 削除/引用 No.5402-12 - 2016/09/15 (木) 19:45:39 - が ちなみに、MidoriGreenは”最悪”な染色試薬です。 日本ジェネティクスはMidoriGreenが劣悪品だと認識していて、販売しています。 うちは、散々検討した結果、GelGreenに乗り換えました。

(無題) 削除/引用 No.5402-11 - 2016/09/15 (木) 15:49:18 - AP ミドリグリーンはErBr代替の「DNA染色剤」として売られていてRNA染色は勧められていないようですね。DNA染色でEtBrと同等の感度といっていますから、RNA染色でもEtBr同等であんまり感度高くないんでしょう。

(無題) 削除/引用 No.5402-10 - 2016/09/15 (木) 01:33:23 - が 鋳型DNAにRNaseがコンタミしてたら、IVT合成してもすぐに分解されます。 もういちど、制限酵素処理後にフェノクロ精製しなおしたテンプレートを使うとうまくいくでしょう。

(無題) 削除/引用 No.5402-9 - 2016/09/14 (水) 17:06:58 - AP IVTやそれを利用した標識ヌクレオチドの取り込みは鋳型の長さや配列によって進みやすさが異なるものですが（例えば長い鋳型では完全長まで伸びにくい）、230 ntなら十分に短いのでどんな配列であれ（よっぽど偏った配列でなければ）、あんまり心配要らないと思います。

(無題) 削除/引用 No.5402-8 - 2016/09/14 (水) 17:03:56 - AP 適切に電気泳動をしていない場合、バンドが見えない可能性はあります。 ・変性していないためにRNA分子の移動度が一定にならずフォーカスしないので、バンドが見えない。 ・ゲルの濃度が適切でない（低分子用でない）ためにバンドが拡散して良く見えない（200 ntならアガロースゲルでも2%くらいのゲルなら十分分画できるサイズ）。 非変性ゲルでも、サンプルを変性ゲル電気泳動法と同様に変成してから泳動するとかなりちゃんとバンディングします。サンブル変性時に少量のEtBrを入れておくと、インターカレーションでない様式（架橋？）でRNAに結合するので高い感度で染めることができる。 IVTでのプローブ作製は、うまくいくと鋳型インプット（重量ベースでなく分子数で）の20倍程度の収量があるというけれど、なかなかそうは行かない。数倍とかせいぜい二倍とかいうこともある。一方、電気泳動での核酸の染色強度は重量ベースでの核酸量と比例する。 IVTのターンオーバー（鋳型数の数倍）と230 ntという分子量の小さいRNAであった場合、検出可能な物質量が泳動されているだろうか（おそらく一本鎖RNAだと1バンド少なくとも数十ngは必要）。 それと、くり返し言うけれど、なぜまずスポットテストなどでラベルの評価をしないのか？　メンブレンにはある程度の大きさのDNAやRNAしか結合せず、フリーの標識ヌクレオチドはつかないので、どのくらいの力価で標識が検出できるかをみることで、取り込み量（≒収量）も力価も評価できる。どこの製品でやっているか知らないけれど、すくなくともRoche (DIGシステム）では、それがマニュアル通りの標準の方法である。

(無題) 削除/引用 No.5402-7 - 2016/09/14 (水) 13:00:36 - seventh DIG-UTPの取り込みによるラべリングではDIG-UTP濃度が高いと合成量が低下することがありますが、濃度を振ったりDIGなしNTPでの合成は確認していますか？ 他の方も言われていますが、UVによる定量は行っていますか?

(無題) 削除/引用 No.5402-6 - 2016/09/14 (水) 12:45:10 - みるきー 多くのご返信ありがとうございます。 RNAの電気泳動はRNAが合成されていることを確認する目的で行いました。 検出方法は以前はEtBrを使用していたのですが、ラボの方針で現在はMidoriGreenという試薬を使用しています。EtBrはインタカレーションによる検出ですがこの試薬で染まる原理はメーカーの方で明らかにされていないので分からないです。 他のラボのメンバーも同じようにRNAプローブを作製しているのですが、最後のRNAが合成されているかどうかの確認にアガロースゲルとMidoriGreenの組み合わせで検出できています。 アガロースゲルだと正確なサイズを確認するのには不向きであることは分かるのですが、合成されているかどうかを判断するだけの場合でも変性ゲルを使うべきなのでしょうか。 また、プラスミドにはPROMEGAのPgemteasyを使用しており、シークエンスでもプロモーターが正しいことを確認しています。NTPはDIG Labeling mixに含まれいてるものを使用しています。エタ沈のあとの上清は陰圧で吸引した後、2min程度逆さで乾かしてからdwに溶かしています。 長々と申し訳ないですがご返信よろしくお願いします。

染めなくても 削除/引用 No.5402-5 - 2016/09/14 (水) 00:02:11 - ふみ 沢山RNA合成したら、PAGEのあとにUV当てるだけで濃い影のバンドができてそこにRNAがあるのが分かります。

検出 削除/引用 No.5402-4 - 2016/09/13 (火) 23:57:19 - ふみ 尿素入りのPAGEで流してからEtBr(あるいはもっと望ましくは一本鎖が染まる試薬)で観たらそれほど検出に困難はないと思います。 それよりも、プロモーターの配列は合っていますか。それから、NTPはちゃんとしたのを使っていますか？エタ沈のあとは上清をきちんと除去していますか？

(無題) 削除/引用 No.5402-3 - 2016/09/13 (火) 23:52:47 - おお 精製してUVで定量してみた？ RNaseがコンタミしているならプラスミドをフェノクロで改善されるかもしれません。周りに経験がある人がいたら相談してみてください。 わたしはRNA合成した場合はPAGEで変性した条件で泳動します。

(無題) 削除/引用 No.5402-2 - 2016/09/13 (火) 21:39:15 - AP どうやって電気泳動してどうやって検出しているのか？ RNA プローブは一本鎖なので非変性ゲルではシャープにバンディングしないしどのくらいの移動度で出てくるかもわからない。EtBrなどのインターカレーター型の色素では感度が低い。 一番いいのはフォルムアルデヒドなどの変性ゲルで流して、メンブレンにブロット、標識の検出法で検出すること。 それど、そもそも泳動がそんなに大事だろうか？それより、標識力価をドットブロットなどで評価するほうが有用。

in vitro transcription RNAが生成されない 削除/引用 No.5402-1 - 2016/09/13 (火) 19:04:03 - みるきー こちらの掲示板をいつも参考にさせて頂いてます。 初めての投稿なので伝わりづらい部分が多々あると思いますがご容赦ください。 現在、in situ hybridization用のRNAプローブを作製しようとしているのですがin vitro transcriptionして電気泳動を行うとバンドが確認できません。 プロトコルとしてはプラスミドに目的の配列をライゲーションして大腸菌に組み込み増やしてからプラスミド精製して制限酵素で直鎖化してから転写を行っています。 制限酵素処理後の電気泳動では目的のサイズの位置にバンドが見えたため、ここまでの操作は良さそうに思えたのでRnaseのコンタミかと思い、dwやEtOHなどの試薬を新しく調整して制限酵素処理後に30分間ProK処理した後、PCI抽出エタ沈を行ってから転写をしたのですが改善されませんでした。 templateの精製度や制限酵素と転写の酵素の組み合わせにも問題なく、制限酵素も５’突出末端になるものを使っています。 因みにinsetのサイズは230 bpです。RNAプローブとしては短いと思いますが実験の都合上これ以上長くできません。 一ヶ月以上同じ操作を繰り返しており、抜け出せなくなって困っています。 どなたか良い解決策を知っている方がいらしたら是非ご教授ください。 よろしくお願いします。

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