全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.5426-12 - 2016/10/01 (土) 13:25:15 - DSC しばらくお返事できずすみません。 APさんのゲルろ過のアイディアが、いちばん現実的で簡単ですね。 ロスは当たり前ですが、試してみようと思います。 皆さま、ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.5426-11 - 2016/09/25 (日) 23:58:11 - mon 濃縮・buffer置換・精製、いずれにしろ収率は100%ではないから、ロス（時間・労力も含む）も考えてください。

(無題) 削除/引用 No.5426-10 - 2016/09/24 (土) 17:12:54 - AP >反応体積程度に希釈した必要量の酵素を、 考えてみたら、そうする必要なかったです。 反応体積より小さく、カラムのキャパにあった容量であればよし。 終体積はろ液に反応バッファーを加えて合わせればいいですから。

(無題) 削除/引用 No.5426-9 - 2016/09/24 (土) 15:59:40 - AP 濃縮するという発想を変えて、 グリセロールなど酵素保存液の成分を高濃度で含む反応液を、通常の反応バッファーで置換すればいいわけだから、 反応体積程度に希釈した必要量の酵素を、反応バッファーで平衡化したゲルろ過スピンカラム（G-25やS-300など）に通す。濾液はほぼ元の体積になるはずで酵素は理論上すべて回収され、そのまま反応できるバッファー条件になっている。ATPとか基質核酸などはあとから加えてもいい。 限外濾過膜でも濃縮ではなくバッファー交換としてやるほうがうまくいきそう。

(無題) 削除/引用 No.5426-8 - 2016/09/24 (土) 11:42:20 - toto 50％グリセロールに溶けてる微量の薄いタンパク溶液をしかもRNase-freeで濃縮するというのは、アセトン濃縮や硫安沈殿なんて、ちょっと無茶な気がします。 確かに、希釈して粘性を下げて遠心型のメンブレン濃縮するがベストでしょうが、あきらめて買い直した方が賢明な気がします。あえて高濃度の酵素を使っておられるということは、行きにくい反応をされておられると思いますので、特に。あるいはその少ない酵素量で長く反応させるという手も、とりあえずはやってみる価値はあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5426-7 - 2016/09/24 (土) 10:19:27 - mon RNaseのコンタミが心配だけど。。

(無題) 削除/引用 No.5426-6 - 2016/09/23 (金) 21:10:04 - ANO ダメモトでよいなら、その薄いのを使って、 反応時間を長めにしてみたらよいのでは？ 2000分の350しかなくても、つながる奴が 多少はできるのでは？

(無題) 削除/引用 No.5426-5 - 2016/09/23 (金) 18:00:12 - AP 硫安沈殿だと透析で硫安を抜かないとならず、かえって薄まる可能性が高いと思うのですけど。結局、そのあと上手い濃縮法があるかどうか（それこそ限外濾過？　遠心エバポ？）が一番のポイントになると思います。 その一番のポイントをどうするかを置けば、硫安沈殿はいい方法だと思います。 昔は、市販の酵素でもリコンビのものはなくて、由来生物から内在性の酵素を精製した製品だったこともあって、安定に保存・流通させるのが困難なものが多かった。そういうときどうしていたかというと、硫安沈殿で出荷してたんですね。受け取ったら自前で透析して使用していたんです。たとえばCIAP。本当にウシの腸から取ってたんで、プロテアーゼ活性なんかが完全に排除出来なかったんでしょう、そうやって売られてたようですよ。 雑談でした。

(無題) 削除/引用 No.5426-4 - 2016/09/23 (金) 17:39:00 - DSC >APさん まあ、そうですよねえ、、、 ただ、通常濃度品を125,000 Uも買ってしまったのと、最近私も周りもDNAライゲーションに単独のLigaseを使っていない（PEG系のバッファーを含む2X pre-mixを使用している）ので、使い切るにはほど遠くて、、、 こういうののオークションとかあれば出すんですけど（怪しいから買う人いないか、、、）。誰かもらってくれる人を探してみます。 >うんとさん アセトン濃縮か硫安沈殿ですね。隣のラボはタンパク（酵素）を扱っているので、相談してみます。

(無題) 削除/引用 No.5426-3 - 2016/09/23 (金) 15:39:37 - AP その酵素は普通のライゲーションに使うことにして買いなおすのが一番じゃないか。 ヘンにいじってligaseをお釈迦にするとか、反応条件が同一かどうかわからないような実験をしてもタメにならないかと。

(無題) 削除/引用 No.5426-2 - 2016/09/23 (金) 14:46:57 - うんと アセトン濃縮か硫安ですね。

市販の酵素を濃縮したい！ 削除/引用 No.5426-1 - 2016/09/23 (金) 14:17:50 - DSC 私自身の手違いが原因で、お恥ずかしい話ですが、、、（高濃度のT4 DNA Ligaseを購入すべきところを、誤って通常濃度品を購入してしまいました） Splint DNAを介したRNA fragmentのLigationのため、普段は高濃度（2,000 U/uL）のLigaseを反応溶液の1/20 v加えていますが、通常濃度品（350 U/uL）で同じ酵素濃度にしようとすると反応溶液の1/4 v以上を加えなければならなくなります。酵素に含まれているグリセロールや塩が反応に影響しそうなので、可能ならば酵素を濃縮してから加えたいと考えています。 市販品のDNA修飾酵素を濃縮する良い方法はありませんか？　一応メーカーには尋ねましたが、どんな手段もとにかく「保証できない」の一点張りで（そりゃそうでしょうけど）。限外ろ過とか提案してみましたが「粘性が高いから無理では？」とのこと。限外ろ過膜にはよくグリセロールが染み込ませてあったりするので、粘性はあまり関係ないのでは？とも思うのですが。もちろんそういう余分のプロセスである程度失活させてしまうのは承知の上です。 皆さま、いかがでしょうか？　ダメ元ですが、お知恵をお貸し頂けると幸いです。

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---