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(無題) 削除/引用 No.5429-5 - 2016/09/27 (火) 10:00:09 - AA Cas9ベクターがpX458であれば、たしか9kbpちょっとあったと思うので、 GFPのみを発現するベクターと比べるとどうしても トランスフェクション効率は変わると思います。 なので理想的にはやはりco-transfectionではなく、 Cas9ベクターのsingle transfectionで評価できるほうが良いことになりますが、 トランスフェクション自体がうまくいっている確認のために、 一度先輩のおっしゃられる通りにやられたほうが良いかと思います。 また、これは実際に使った印象で理屈はよくわからないのですが、 pX458はトランスフェクションから日を置くと あっという間にGFPが見えなくなります。 （分子量が大きくて一度のトランスフェクションで入り込む分子数が少ない？） GFPの確認はトランスフェクションの翌日まで、くらいのつもりでいるといいかと思います。 K様のご指摘のように、赤系の強制発現ベクターがあるとGFPと比べられるのでいいですね。

(無題) 削除/引用 No.5429-4 - 2016/09/27 (火) 03:06:45 - K > わざわざGFP強発現ベクターをミックスする必要性がわからなくなってきてしまいました。これはCas9ベクターのトランスフェクションが確実にできていること前提で、GFPを検出できなかった場合、ベクターミックスでGFP検出ができれば、Cas9ベクターにおけるGFP発現が検出限界以下と結論づけることができるのを意図していると理解して良いのでしょうか。 ゆいさんが抱かれている疑問については、ごもっともだと思います。そして、ご理解も正しいのではないかと思います。 おそらく先輩さんは、Cas9ベクタが機能していない可能性を一番に考えている、もしくは最初に否定したいとお考えなのではないでしょうか。 もし追加するとすれば、GFP発現ベクタとともに、RFPやmCherry発現ベクタを用いた実験も考えてみてっもいいかもしれません。赤色が検出できていればトランスフェクション成功、そのうえで緑色が検出できるかを見れば、情報の精度が増すように思います。もしくは、Cas9ベクタの設計がどのようなものかわかりませんが、ミックスした条件でGFPが検出されたとして、何らかの方法でCas9ベクタの機能を検定できればそれでもよいかもしれませんが。 ＞Cas9ベクターにミックスしなくてもGFP強発現ベクターだけをトランスフェクションしたら良いのではと考えはじめているのですが、これではよろしくないのでしょうか。 GFP強発現ベクタと、Cas9ベクタは少なくとも並行して（同じ日に、同じ操作で）みる必要があるでしょう。それだけでも得られる情報は多いと思います。ミックスについては、たしかに得られる情報は多くないように思いますので、上記のような工夫があるとなお良いように、個人的には思います。

Ｋさん 削除/引用 No.5429-3 - 2016/09/26 (月) 23:02:46 - ゆい お返事ありがとうございます。 ご回答内容、非常にためになりました。 また同時にご質問したいことがあります。 絶対にうまくいく条件、つまりPositive controlに関してですが少し混乱してきてしまっています。トランスフェクション効率が高い細胞を用いて、コントロール、Cas9のみ、Cas9+GFP強発現ベクター、の条件を構成する予定ですが、ここでわざわざGFP強発現ベクターをミックスする必要性がわからなくなってきてしまいました。これはCas9ベクターのトランスフェクションが確実にできていること前提で、GFPを検出できなかった場合、ベクターミックスでGFP検出ができれば、Cas9ベクターにおけるGFP発現が検出限界以下と結論づけることができるのを意図していると理解して良いのでしょうか。（すみません文章が変で） だとすると私、Cas9ベクターにミックスしなくてもGFP強発現ベクターだけをトランスフェクションしたら良いのではと考えはじめているのですが、これではよろしくないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5429-2 - 2016/09/26 (月) 22:07:52 - K 以下、トピ主さんの意図を正確に読み取れているかはわかりませんが・・・ 今のところGFPの発現を認められない原因は複数考えられるでしょうが、 ・トランスフェクションがうまくいっていない ・GFPの検出ができていない という2点については、先輩さんが提案された方法でPositive controlをおくことで検証できると思います。 実際に観察している現象が確認されるまでには 細胞培養→トランスフェクション→プラスミドからの転写〜タンパク発現→細胞内でのタンパクの量的な維持→検出（蛍光観察ならその方法の各ステップ、WBならタンパク抽出からバンドの定量的評価までの各ステップ） といった多くの生物学的なステップを経ており、そのどこに問題があるかを突き止めなければなりません。 これには、検証すべき各ステップにおける、的確なPositive/Negative controlをおくことが必須になります。 全てのステップを検証するのは膨大な条件設定が必要になりますが通常その必要はなく、「絶対うまくいく」条件をPositive controlにおき、同時にNegative controlをおいて再検するというのが定石です。その結果をもって再度原因を絞り込み、ふたたび適切なcontrolを設定して、検証を繰り返す。 先輩さんの意図しているのもそういうところなのではないかと拝察します。 またベクタが違えば、分子量や立体構造（コイル化の程度など）でトランスフェクション効率は異なるのが普通です。しかし混合した場合にどちらか一方が取り込まれ、他方が全く取り込まれないということはまず考えられません。今回の場合、3群間のGFP発現の強弱がわかればいいだけですから、先輩さんの提案される検証には問題は生じないと思います。 それから、2種類を同時にトランスフェクションした場合、1細胞に2ベクターが同時にトランスフェクションされるかはBy chanceです。 なので、 ＞Cas9ベクターのGFP発現が微量である問題をGFP強発現ベクターを混合することでリカバリーできないなと思いまして。。。 に関しては、やめておくべきです。 おそらく、GFP発現を目安にCas9発現細胞を効率的に収集し、ゲノム編集がなされた細胞を効果的に抽出しようという意図で単一ベクタにされているはずですから。

トランスフェクションに用いるプラスミド 削除/引用 No.5429-1 - 2016/09/26 (月) 21:00:52 - ゆい こんばんは、トランスフェクションを行う際のプラスミドについて質問させて下さい。 特定の遺伝子をノックアウトするために、Cas9ベクター(GFPを発現)に目的配列をライゲーションしたものを先日細胞にトランスフェクションさせました。ですが、全くGFPの発現が見られず、細胞にプラスミドが入っていない、GFPは発現しているが発現レベルが微量、プラスミド自体が機能していない可能性が考えられました。そこで先輩からGFPを強発現するプラスミドと今回用いたCas9ベクターを混合させ、トランスフェクション効率がほぼ確実な細胞を用いて、再実験をしてみては？というアドバイスを頂きました。 方法としては、コントロール、Cas9ベクターだけのもの、Cas9ベクターとGFP強発現ベクターの三種に分け、それぞれをトランスフェクションができなかった細胞株とトランスフェクション効率がほぼ確実な細胞にトランスフェクションさせる、との教授を頂きました。 そこで疑問があるのですが、Cas9ベクターとGFP強発現ベクターを混合させる際、ノックアウトする目的配列を含んだCas9ベクターと目的配列をライゲーションしていないGFP強発現ベクターをただ混合するだけで良いのでしょうか？教えていただいたプロトコルには特に記載がなかったのですが。。。それとも目的配列をライゲーションしたGFP強発現ベクターを混合する方法で良いのでしょうか？ またこの２つのベクターは必ず同時に1細胞に取り込まれるのですか？ もし別々に取り込まれるならCas9ベクターのGFP発現が微量である問題をGFP強発現ベクターを混合することでリカバリーできないなと思いまして。。。 どうかご教授下さいませ。

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