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(無題) 削除/引用 No.5436-26 - 2016/10/01 (土) 12:28:37 - 中年 pUCタイプの複製起点とpBRタイプの複製起点では、大腸菌中でのコピー数は数十倍の違いがあります。 https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/8910/8910_yomoyama-2.pdf

(無題) 削除/引用 No.5436-25 - 2016/10/01 (土) 08:00:33 - 三毛猫 Chellieです。 昨晩、4度で置いていたプレーティングした際の残りの大腸菌を、予めアンピシリンを50マイクロg/Lで加えたプレート（紫外線照射無し）にまき、翌日沢山でたコロニーのうちから6つをミニカルチャーし、ミニプレープしてみました。 EcoRVとNot1でカットしてみました。 セルフライゲーションの場合、1812bpと3158bpが出るはずです。目的のインサートが入っていれば、2604bpと3158bpがでるはずでした。 結果は、期待通りのバンドがでてくれました！ 中年さま、皆様この度はありがとうございました！ ただ、シークエンスが正しいか、これが本当のプラスミドなのかはまだわかりません。 シークエンスは外注になりますので、来週の結果が楽しみです。 一点とても驚いたことがあります。 ローコピーと教えてはいただいたのですが、いつものほ乳類細胞用プラスミドで得られるミニプレプ産物の量に比べ、1/10-1/20ほど採れてきた量が減っているようです。これほどまでに少ないのは予想通りなのでしょうか？すごくびっくりしています。 > 先にも書きましたが、CIAP処理をしていなくてもゲルから切り出しているのであれば、そこからインサート無しのライゲーションで得られる形質転換体は、理屈の上からは末端がおかしな形で削れたか切れたしてつながったものだけなので（現実的にはEcoRIかNotIの切れ残りのone cutされた分子は環状化する）、元のpGEXベクターと構造が違うのは当たり前だと思います（特に無茶な濃度のアンピシリンで選択すれば）。 ダブルの酵素を入れているのにシングルカットしかされなかったものもセルフライゲーションの原因になりますでしょうか？はい、アンピシリンには今回とても学ばされました。 この度は本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5436-24 - 2016/09/30 (金) 09:17:18 - 中年 プレートのUV照射は、古いプレートがコンタミしているかもしれないので、使用前に滅菌しておこうという配慮でからしょうか。まずはそれを止めて、新規に作製したアンピシリン（50uL/mL程度）プレートを使用することで問題は解決するのではないかと思います。 先にも書きましたが、CIAP処理をしていなくてもゲルから切り出しているのであれば、そこからインサート無しのライゲーションで得られる形質転換体は、理屈の上からは末端がおかしな形で削れたか切れたしてつながったものだけなので（現実的にはEcoRIかNotIの切れ残りのone cutされた分子は環状化する）、元のpGEXベクターと構造が違うのは当たり前だと思います（特に無茶な濃度のアンピシリンで選択すれば）。

(無題) 削除/引用 No.5436-23 - 2016/09/30 (金) 02:20:53 - Chellie AP様、引き続き、ありがとうございます。 コロニーPCRはせずとも、insertをいれた方で1000個近くコロニーが出たので、当然ほとんどが目的のプラスミドを持っているとばかり思っていました。大過剰量のアンピシリンを使ったことは本当に愚かでした。 boiling methoudという方法があるのですね。 http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0023457 詳しく見るといろんな方法があるようですが、上記では以下5ステップになるようです。 lysozymeは買わねばなりませんが、一見すると簡単そうです。 AP様は、以下の方法で行われていますか？またお気づきになりましたら教えていただけると幸いです。ありがとうございます。 1.5-2 ml of bacterial cultures were pelleted at 6000-7000 rpm for 1 min. After drawing 150 µl extraction buffer into a pipette tip, the pellet was loosened off the tube wall with the tip without releasing the buffer. Then the extraction buffer was added and the pellet resuspended. The bacterial suspension was incubated at 65°C for 5 min. Suspensions were centrifuged at maximum rpm for 10 min or until a tight bacterial pellet was formed. The pellet was removed with a toothpick. 100-120 µl isopropanol was added, followed by mixing and centrifugation of the solution at 7000 rpm for 10 min at RT. ＊The composition of the extraction buffer was: 5% sucrose, 20–50 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8, 0.75 M NH4Cl, 0.5% IGEPAL CA-630 (or Triton X-100), lysozyme 100 µg/ml, and RNase A 25 µg/ml.

(無題) 削除/引用 No.5436-22 - 2016/09/30 (金) 02:17:18 - Chellie >[Re:19] 中年さんは書きました : > 高コピーならなんとか大丈夫な濃度だと思いますが、低コピーのプラスミドでしかも形質転換後に播きだしてるんですよね？ はい、アンピシリンは形質転換後に播きだしていました・・ BLT様、ありがとうございます。 アンピシリンは新しいものを購入しておこなっていましたので、失活はしていないと思っています。

(無題) 削除/引用 No.5436-21 - 2016/09/30 (金) 02:04:43 - Chellie Chellieです。中年様ありがとうございます。 いえ、CIAP処理はしていません。double digestionの際には基本的にCIAP処理をこれまでにしてきませんでした。はい、制限酵素で処理後、gelから切り出しています。 切断パターンはoriginalのものとmini prepしたものをBamH1とEcoRVで処理すると大きなfragments 2つに分かれますが、それらのパターンがmini prepしたものでは全く違うんです。 中年様のお話を伺い、私は本当に馬鹿なことをしていたようです。 そうですね芳香族アミノ酸はUVに吸収を持つことは初歩的な知識です。また今回のプラスミドがローコピーということであれば、これほどのアンピシリン濃度でセレクトされてくる大腸菌はおかしなものが取れて当然の気がしてきました。 本当に浅はかなミスをしていました。また、それに気づかせていただき、心から感謝しています。

(無題) 削除/引用 No.5436-20 - 2016/09/29 (木) 20:52:54 - AP >今のラボは自動プラスミド抽出機がないので、マニュアルでP1->P3にエタチンと結構な労力なので、いかほどクローンをピックせねばならないか予想もできませんよね。。。 数撃ちゃ当たるの力技はスマートじゃないのでやりたくないですし、おすすめもしませんが、 アルカリSDS（フェノール抽出なし）でも24サンプル二回くらいは一日でまわせるかな。でも多サンプルのプラスミドを精製してスクリーニングするならbioling methodが手順が簡単でone tubeでできるので良いです。培養もマイクロチューブでやって（容量の半分くらいの培地、フタはとじて振盪培養）そのままプラスミド精製にいってもいいです。収量が低くても制限酵素消化して電気泳動で流してみるには十分。 とは言え、いまならコロニーPCRでスクリーニングするのが定番でしょう。100や200なんてあっという間。

(無題) 削除/引用 No.5436-19 - 2016/09/29 (木) 20:18:01 - 中年 高コピーならなんとか大丈夫な濃度だと思いますが、低コピーのプラスミドでしかも形質転換後に播きだしてるんですよね？

(無題) 削除/引用 No.5436-18 - 2016/09/29 (木) 19:05:31 - BLT そのアンピシリン、失活してるんじゃない？

(無題) 削除/引用 No.5436-17 - 2016/09/29 (木) 16:16:41 - 中年 > 何か起きていそうですよね・・気持ち悪いので、UV照射後に100 mg/mlのAmpiciliinを50 ulほど更に塗るという操作をしていました。 プレート１枚あたりLB 20 mLとして、それだけで250 ug/mLですよ！そんな高濃度で生えてくる形質転換体って・・・

(無題) 削除/引用 No.5436-16 - 2016/09/29 (木) 16:07:22 - Chellie AP様、引き続き、コメントをお寄せ下さり心から感謝しております。 はい、目的のタンパク質は哺乳細胞で発現させた場合（pcDNA3.1+）、N末の分泌シグナルが機能し、細胞外へ分泌されます。また、C末にはMyc-Hisx6タグが付いています。 この度大腸菌にてpGEX-4T2を利用して発現させるため、ATGおよび分泌シグナルを除いてものをcloningしようとしていました。これが、PCRをかました理由となります。 > それに、先に書いたようにPCR産物末端の制限酵素消化はビックリするくらい効率悪い。これは、制限酵素消化後のPCR産物のみでligation反応して、重合したバンドがどれだけ出てくるかでわかります。やってみると大部分モノマーで残っていました。 これは知りませんでした。そうなんですね・・・うまくいっていると思っているligationを疑う必要もありそうですね。一度深く考えてみます。ありがとうございます。 > 有機物のクロスリンクが起きて変質しそうだなあ（アミノカルボニル反応とか）。なによりも、抗生物質入りならそれがやられそう。 何か起きていそうですよね・・気持ち悪いので、UV照射後に100 mg/mlのAmpiciliinを50 ulほど更に塗るという操作をしていました。

(無題) 削除/引用 No.5436-15 - 2016/09/29 (木) 16:03:04 - おお >だったらなぜpcDNA3.1からりクローニングしないんだろう？ ホントだ

(無題) 削除/引用 No.5436-14 - 2016/09/29 (木) 16:01:15 - 中年 > 一つおかしな操作を実はしているんです。。 > 先輩から指摘されて、冷蔵庫に保存している未使用LB plate（作製して1週間も経っていませんが）を使用直前に1時間ほど細胞培養を行うフードにてUV照射をしてみたら？と言われ、そのようにしています。もちろん私がLB plateを作製した際にはオートクレーブ滅菌したLB/agarを使っていましたが、先輩の指示に従っています。 これは一体何のためでしょうか？ ビタミンやトリプトファンなどボロボロになるんじゃ？

(無題) 削除/引用 No.5436-13 - 2016/09/29 (木) 16:01:05 - おお PCRについてはシングルでバチッとバンドが見えても例えばその中に数％変なのが混じっていて思いっきりそれが邪魔しているとか、まああまり理論的ではないのですがPCR自体いろいろなことが起こりえる方法ですから結構警戒しています。 なのできれいなバンドがでてもうまくいかないならどんどんアニーリング温度を上げて、バンドが消える温度の一つ手前ぐらいまで上げた状態でものを取ってきたりします。プラスミドでがテンプレートで３０サイクルは多すぎでしょう。２０ぐらいで十分じゃないでしょうか。よほどプライマーに癖があって効率が悪いのなら仕方ないかもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.5436-12 - 2016/09/29 (木) 15:56:52 - 中年 pGEXベクターはEcoRIとNotIで消化した後、CIAP処理をされているのでしょうか、それともゲルから切り出されているのでしょうか。どちらにせよ、そこからインサート無しのライゲーションで得られる形質転換体は、理屈の上からは末端がおかしな形で削れたか切れたしてつながったものだけなので、元のpGEXベクターと構造が違うのは当たり前だと思います。 pGEXベクターをそのまま形質転換して増やしても、制限酵素の消化パターンが異なるという方が問題は深刻だと思います。違った切れ方と仰っていますが、切断パターンは完全消化されていることは間違いないでしょうか（各バンドの強度がサイズに比例している＝等モルある）？ それ以外に考えられることがあるとしたら、アンピシリンの濃度が高すぎる？まず大丈夫だとは思いますが、低コピーなので無茶な濃度のアンピシリンでおかしなものが選択されてきている可能性もゼロではないかも。

(無題) 削除/引用 No.5436-11 - 2016/09/29 (木) 15:55:15 - AP >pGEX-4T1や4T2にクローニングしようとしている同じ遺伝子を、同じ制限酵素でpcDNA3.1+にcloningしていたので、EcoR1とNot1はいずれもきちんと働いていると思います。 だったらなぜpcDNA3.1からりクローニングしないんだろう？ いちいちPCRで取っていたらmutationのリスクが上がるだろう。 それに、先に書いたようにPCR産物末端の制限酵素消化はビックリするくらい効率悪い。これは、制限酵素消化後のPCR産物のみでligation反応して、重合したバンドがどれだけ出てくるかでわかります。やってみると大部分モノマーで残っていました。 >先輩から指摘されて、冷蔵庫に保存している未使用LB plate（作製して1週間も経っていませんが）を使用直前に1時間ほど細胞培養を行うフードにてUV照射をしてみたら？と言われ、 有機物のクロスリンクが起きて変質しそうだなあ（アミノカルボニル反応とか）。なによりも、抗生物質入りならそれがやられそう。

(無題) 削除/引用 No.5436-10 - 2016/09/29 (木) 15:48:40 - Chellie おお様、引き続きありがとうございます。 PCRのテンプレートは、plasmidです。 哺乳動物用pcDNA3.1+に以前にcloningしていたので、それを使っています。 95度, 3 min -> (95度, 10 sec -> 57度, 20 sec -> 72度, 1 min) x 30 cycles -> 72度, 3 min -> 12度, over night でPCRしています。30 cyclesも必要ないかもしれませんし、特異性が高いPCRです。

(無題) 削除/引用 No.5436-9 - 2016/09/29 (木) 15:44:32 - Chellie おお様、ありがとうございます。 >[Re:7] おおさんは書きました : > ホストとの相性は理論的な部分に加えあまり理論的でないけど変えるとうまく行ったということもあるので、私はライゲーションまでの系が働いていてそれでもうまく取れないならすぐに違う大腸菌を試します。 了解しました。ぜひぜひ試してまたアップデートさせていただきます。 AP様、おお様、この度は本当にありがとうございます。 > まあ何が理由かわかりませんけど、pGEX-4T1のからベクターを入れてもプラスミドが取れない状態ならそれが原因でインサートが入ったものも取れないのかもしれません。自家製で増やすのを繰り返す中でちょっと性質が変わってきているかもしれませんね。。。貰ったラボでそのベクターを増やすときなどにつかっている大腸菌とか分けてもらうってのもありかなと。 pGEX-4T1は韓国人の友人からもらいましたが、彼はそのプラスミドを韓国から持ってきており、大腸菌は持っていないと言っていました。私が所属する部門は分子生物学が盛んではないので、他ラボをあたり同じプラスミドで形質転換された大腸菌を得ることは難しそうな気がしています。 > 細かい実験手順も見ていくべきかと思いますけど、まずはそのへんからか検証した方がいいような気がします。 > > それと、制限酵素がちゃんと働いているかはどのように検証していますか？ pGEX-4T1や4T2にクローニングしようとしている同じ遺伝子を、同じ制限酵素でpcDNA3.1+にcloningしていたので、EcoR1とNot1はいずれもきちんと働いていると思います。 ligationまではうまくいっている気がしているんです。 その後の形質転換が怪しい気がしています。もしお時間ありましたら一度見ていただけないでしょうか？ 1. ligation産物をhome made DH5alpha 100 ul on iceに加え、20 min氷上で静置 2. 42度、35 sec heat shock 3. on ice, 3 min 4. 冷LB 1 mlを加え、1時間shaking, 37度 5. 一度10000g, 1 minで遠心して古いmediumを捨てたのち、50 ul LBで懸濁して、そのうち45 ulをLB plate containing ampicillinにplateする 6. 一晩37度で培養したのち、colony check。基本的にnegation (insert無しでvectorのみをligateしたもので形質転換したplate)でコロニーが少なく、一方、insertありの方でコロニーが多く出ていれば、ligationに確信を持ってmini cultureに進めています。 mini prepは自作P1 -> P3のものを使用し、エタチンして電気泳動しています。 一つおかしな操作を実はしているんです。。 先輩から指摘されて、冷蔵庫に保存している未使用LB plate（作製して1週間も経っていませんが）を使用直前に1時間ほど細胞培養を行うフードにてUV照射をしてみたら？と言われ、そのようにしています。もちろん私がLB plateを作製した際にはオートクレーブ滅菌したLB/agarを使っていましたが、先輩の指示に従っています。

(無題) 削除/引用 No.5436-8 - 2016/09/29 (木) 15:31:36 - おお あとですね。PCRの段階から変かもしれません。わたしは収量はそんなに必要ないのでなるべく厳しい条件になるように、かかるギリギリぐらいの条件で取ってくるように心がけています。

(無題) 削除/引用 No.5436-7 - 2016/09/29 (木) 15:25:22 - おお ホストとの相性は理論的な部分に加えあまり理論的でないけど変えるとうまく行ったということもあるので、私はライゲーションまでの系が働いていてそれでもうまく取れないならすぐに違う大腸菌を試します。 まあ何が理由かわかりませんけど、pGEX-4T1のからベクターを入れてもプラスミドが取れない状態ならそれが原因でインサートが入ったものも取れないのかもしれません。自家製で増やすのを繰り返す中でちょっと性質が変わってきているかもしれませんね。。。貰ったラボでそのベクターを増やすときなどにつかっている大腸菌とか分けてもらうってのもありかなと。 細かい実験手順も見ていくべきかと思いますけど、まずはそのへんからか検証した方がいいような気がします。 それと、制限酵素がちゃんと働いているかはどのように検証していますか？

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