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(無題) 削除/引用 No.5452-16 - 2016/10/14 (金) 13:07:05 - miniprep ぺーぺー様 情報ありがとうございます。 今後の参考にいたします。 ああ様 ありがとうございます。 vitro useでは私と同じですね。 Vivoに戻す際はカラム、参考にいたします。 皆様 spin MiniprepのをそのままPlatEにトランスフェクションしてウイルスを作製してみました。 GFPではないのと、まだ途中なので、 はっきりしたことは言えないのですが、 なんとなくちゃんとできそうな気がします。 PlatEはそこまでSensitiveではないのかも。 とりあえずありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5452-15 - 2016/10/08 (土) 21:23:09 - ああ 以前、PlatEでウイルスを作製していましたが、作製したウイルスをcell lineに遺伝子導入するぐらいであれば、PCI＋エタ沈殿のプラスミドでも問題なく遺伝子導入できてました。 プライマリーの細胞にレトロウイルスで遺伝子導入して、vivoに戻すような実験の場合は、さすがにカラムで精製したものを使ってました。

(無題) 削除/引用 No.5452-14 - 2016/10/08 (土) 12:16:33 - ぺーぺー 以前、プロメガのエンドトキシンが除けるというシリカカラムPureYield miniprepシステムを使ったことが有ります。 Endotoxin Removal Washでカラムを洗う操作が加わるだけです。 ちゃんと比較したわけではないですが、日本ジェネティクスのカラムでは死んでしまう細胞に入れることができました。 ちょっとお高かったと思いますが、サンプルとかもらえるんじゃないかと思います。 https://www.promega.jp/products/dna-purification-quantitation/plasmid-purification/pureyield-plasmid-miniprep-system/ https://www.promega.jp/resources/protocols/technical-bulletins/101/pureyield-plasmid-miniprep-system-protocol/

(無題) 削除/引用 No.5452-13 - 2016/10/07 (金) 12:20:54 - miniprep AP様、おお様、たぶん様 あまりにKitの中身について理解できていないことに気付きました。 ありがとうございます。 たぶん様の仰るように、やってみます（やってみてます）。

(無題) 削除/引用 No.5452-12 - 2016/10/07 (金) 00:54:38 - たぶん いや、自分でGFP発現プラスミドで実際に試してみたら？　たぶんイクと思うけど、結局は定量的な問題。

(無題) 削除/引用 No.5452-11 - 2016/10/06 (木) 22:18:22 - おお AP さん。確かにイオン交換をつかうQIAGENのキットはかなりセンシティブな細胞や、エンドトキシンによるシグナル系が関与する（関与しないと言い切るのは難しいですけど）実験系ではたいてい使えますね。セシクロの代替え的なところもあったかもしれません。ただ徐々にその後シビアになってきてエンドトキシンフリーのキットも出るようになりました。 TX114をつかったキットが昔プロメガから出てました。いまはプロメガはそういったたぐいのものを見ないのであるかわかりません。

(無題) 削除/引用 No.5452-10 - 2016/10/06 (木) 21:52:35 - AP カラムでもただのシリカじゃなくてイオン交換樹脂系(元祖キアゲンのような)は、そもそもCsCl超遠心と同等に細胞毒性がないということで広まったんですよね、

(無題) 削除/引用 No.5452-9 - 2016/10/06 (木) 21:27:37 - AP Triton X-114処理は定番ですかね。文献いろいろあります。あとゲル濾過もあるかな。

(無題) 削除/引用 No.5452-8 - 2016/10/06 (木) 21:26:22 - miniprep 小言幸兵衛様 イソプロ沈殿のをTransfectionしてうまく行ってた人がいたという情報、 あるいみ勇気が出ました。 ありがとうございます。 おお様 エンドトキシン除去、Tritonも含めて考えてみます。 簡単に、簡易的にでもいいのでわかるといいのですが・・・ 吸光度比が異常値を示しやすいなどあればいいのに。

(無題) 削除/引用 No.5452-7 - 2016/10/06 (木) 20:58:52 - おお 確かにアルカリ法でペグ沈とフェノクロ噛ませたぐらいで平気な細胞はありますね。なのでキットがポピュラーになる前はそれくらいのグレードで実験やっている研究室も結構あったんじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.5452-6 - 2016/10/06 (木) 20:55:50 - おお >そもそも飽和尿素でエンドトキシンが除去できるのですね。 検証していません。ただ毒性はかなり除けます。QIAGENのイオン交換カラムではエンドトキシン除去のため吸着後の洗いにデタージェント（おそらくTriton X-100）が使われているようです（でも勝手な思い込みかもしれません）。シリカベースの精製法ではデタージェントを使うと多分効率が落ちるんじゃないかなと勝手に想像してます。そして大抵のミニプレップのキットはシリカメンブレンを使っているようですから、やはりエンドトキシンなどによる毒性が気になります。

(無題) 削除/引用 No.5452-5 - 2016/10/06 (木) 20:55:12 - 小言幸兵衛 アメリカのラボに滞在していたとき、そこのポスドクがPCI抽出もしないアルカリ法でiPrOH沈澱しただけのプラスミドをそのままトランスフェクションに使っていて度肝を抜かれたことを思い出しました。HeLaでしたけどね。その仕事はその後Scienceに出てて、なんだかなー。

(無題) 削除/引用 No.5452-4 - 2016/10/06 (木) 16:13:03 - miniprep おお様 ありがとうございます。 TX114もしくは飽和尿素を用いたエンドトキシン除去が重要ということですね。 飽和尿素前後で毒性が軽減されたとのこと。 参考になります。 そもそも飽和尿素でエンドトキシンが除去できるのですね。 勉強になりました。 プロトコルを教えていただけますでしょうか。 私の検索の仕方が悪いのでしょうが、見つかりませんでした。 よろしくお願い致します。 AP様 普段使用しているMidiはCat No./ID: 12643. HiSpeed Plasmid Midi Kitで、 途中（Tipから溶出した部分）からイソプロ、PCIｘ２、イソプロ、エタ、TE溶液としております。 現在の研究室でもともと使われていたもので、 エンドトキシンについて全く気にしてきませんでした。 検索してみたところ、エンドトキシンFreeではないと思いますが、 Midiの方では用途に（spin miniprepとは異なり）Transfectionも含まれており、 spin miniprepよりは低エンドトキシンのようです。 細胞によっては大丈夫かも、そうなのでしょうね。 ウイルスの作製はPlatEで行うつもりですので、 これに毒性なく入ってくれれば・・・。 shが効くかのCheckのためにはその都度使用している細胞が違いますし。 実際、一度やってみようと思います。 とりあえずspin miniprepそのまま、もしくは尿素処理プラスミドから。 ありがとうございます、参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.5452-3 - 2016/10/06 (木) 14:55:44 - AP 要はエンドトキシンがどれだけ除けているかということで、エンドトキシンがあるとトランスフェクションで細胞が死んでしまうのかこまるんですよね。カラム系のキットなんかでもトランスフェクション可能であることを保証しているものは低エンドトキシンの精製ができる製品です。能書きにエンドトキシンやトランスフェクションへの適応について書かれていないなら、その点は保証しませんよということ。 もっとも細胞によってエンドトキシンの感受性が違うので、エンドトキシンフリーを保証したシステムじゃないと絶対ダメとは言い切れない。実際、ミニプレップ用のスピンカラムで十分な細胞株もある。 その点で言うと、 >普段はMidi kitでプラスミドを取り、PCIとエタ沈で精製したものを用いています。 PCI, EtOH pptではエンドトキシン除去にはほとんど効果ないですから、お使いの細胞ではMidi kit（これはエンドトキシンフリーは保証されていないですね、たぶん）だけで十分ということじゃないか。 だったら、QIAprep Spin Miniprep Kitでも大丈夫な可能性はある。けれど、PCI, EtOH pptが必須かどうかは疑問。

(無題) 削除/引用 No.5452-2 - 2016/10/06 (木) 14:20:52 - おお 何を使って精製するのかによりますがエンドトキシンの含有量が気になるところです。除くてはいくらかあります。Trion X-114を使う方法とか。私はどの程度きれいになるかなど確認してませんが、飽和ウレアを同等の容量加えてその溶液をエタ沈してます。それで毒性がかなり軽減されています。

miniprep精製Plasmidをtransfection可能か。 削除/引用 No.5452-1 - 2016/10/06 (木) 13:41:16 - miniprep 度々参考にさせていただいております。 プラスミドを細胞にトランスフェクションする際の、 プラスミドの精製度について、 皆様のご意見をお聞かせいただきたく思います。 普段はMidi kitでプラスミドを取り、PCIとエタ沈で精製したものを用いています。 少々、手間と時間がかかることから、 Miniprepをそのままトランスフェクションできないものかと考えております。 キットはQIAprep Spin Miniprep Kitを使用しております。 PCI、エタ沈等を行なえば問題なさそうではありますが、 皆様、ご経験はございますでしょうか。 背景としましては、 shRNAによるKD plasmidを作製して細胞に試したいのですが、 設計した効くかわからないshRNAをMidi purificationまでしたくない為です。 ご意見をお聞かせいただけますと幸いです。 よろしくお願い致します。

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