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(無題) 削除/引用 No.5456-8 - 2016/10/18 (火) 12:33:36 - 共培養 確認実験を行いましたが 薬剤誘導なし293×リガンドを発現していない細胞 の条件でも刺激を入れた場合の8割程度の活性が見られました。 また、短寿命型レポーターも試しましたが改善も見られなかったため、この細胞で活性を測定することを断念しました。 他の細胞種に過剰発現して測定できないか検討します。 回答してくださった皆様方には深く感謝申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.5456-7 - 2016/10/11 (火) 20:25:05 - 共培養 東芝様 貴重なご意見ありがとうございます。 予算とデータの優先度の兼ね合いになりますが、短寿命型レポーターの購入を検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.5456-6 - 2016/10/11 (火) 14:46:46 - 東芝 もし、培地中などに恒常的に存在する何らかの因子がリガンドとなり刺激を入れ続けているのだとすると、リガンド刺激を加える前からバックが高いのはどうしようもないですね。 こういった短寿命型のレポーター遺伝子も販売されているようですが、すでにお試しでしょうか？ http://www.promega.co.jp/jp/jp_tech/FAQs/Q&A_Reporter_2.html#pGL4_09

(無題) 削除/引用 No.5456-5 - 2016/10/08 (土) 16:23:49 - 共培養 Karas様 貴重なご意見ありがとうございます。 ご提示いただいた条件がエンド確認になることに全く気付いておりませんでした。 早速試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.5456-4 - 2016/10/08 (土) 13:13:11 - Karas 1,薬剤誘導293×リガンドを発現していない細胞 2,薬剤誘導なし293×リガンド発現細胞 3,薬剤誘導293×リガンド発現細胞 で実験をされてルシフェラーゼアッセイで差が見られないとのことですが 4,薬剤誘導なし293×リガンドを発現していない細胞 の組み合わせで実験されたことはありますでしょうか。 この条件で5桁半ばということでしたら、 �@レポーターが目的とするシグナルと関係なくルシフェラーゼを誘導してしまう　 �Aレポーターの感度に対して誘導前のシグナルが十分高く、誘導しなくてもサチってしまっている のどちらかを考えます。�@についてはレポーターが予想通りの配列かのチェックを行います。�Aであれば細胞を変えるか多少トリッキーな実験が必要かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5456-3 - 2016/10/07 (金) 13:32:22 - 共培養 おお様 説明不足申し訳ありません。 まず実験系について、293にレポータープラスミドを導入すると同時に薬剤でレセプターの発現を誘導します。24h後にリガンド発現細胞を293の10倍量播種してシグナルを導入しています。 回収は共培養開始から7h後です。 293の播種量は96wellに5×10^3個です。細胞の比を検証した際に、この条件が最も活性に差が見られました。 293でのRedundancyですが、目的レセプター自身とそのサブタイプがそれぞれ誘導後の目的レセプターの1/8程度発現しています。 また、リガンドの発現について現在qRT-PCRで確認中ですが、若干していると思われます。 血清中にリガンドは存在していません。 今回 1,薬剤誘導293×リガンドを発現していない細胞 2,薬剤誘導なし293×リガンド発現細胞 3,薬剤誘導293×リガンド発現細胞 で比較を行った際、1,2,3の順に活性が高くなるのですが、1→2と2→3がそれぞれ1.3倍程度しか上昇しません。 ルシフェラーゼ活性の実測値は5桁半ばです。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.5456-2 - 2016/10/07 (金) 12:17:19 - おお もうちょっと具体的にお願いします。redundancyとか、血清がにリガンドがあるとかリポーターをいじったほうがいいとかベースラインは変動しているかどうかとか、蛋白レベルで発現量を抑えているかとか、細胞が良くないとか発現が最初から高いといいますが実測値はどれくらいなのかとか、、、レセプターを誘導したときにリガンド無しで値が上がるのか、誘導しなくても値が高いのかとか、、、 基本的にバックグランドの低い系を選んで実験するのが常套手段だと思うので、やはり細胞の選択も考えたほうがいいかもしれない。

ルシフェラーゼアッセイのコントロールサンプル活性について 削除/引用 No.5456-1 - 2016/10/07 (金) 11:37:11 - 共培養 このフォーラムはいつも参考にさせて頂いております。 トピックの作成は初めてですので、至らない点がありましたらご指摘ください。 現在HEK293を用いてシグナル活性をルシフェラーゼアッセイで測定しているのですが、リガンド刺激を入れないサンプルの活性が高く、レセプターの発現誘導とリガンド刺激による活性の増加が観察しにくい状況となっています。 リガンドとレセプターの発現量は、qRT-PCRとWBで十分に誘導されていることを確認しています。 このような場合に、コントロールの活性を下げる方法はありますでしょうか？ ご意見よろしくお願いいたします。

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