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(無題) 削除/引用 No.5457-9 - 2016/10/15 (土) 13:57:25 - AA 同一染色体上の2箇所に二本鎖切断を起こして大きく欠損させる方法は、 その2箇所に小さなin-del変異が入るだけ、という結果が出る可能性がありますので 多くの人は使わないのではないかなと思っています。 実際、連鎖した遺伝子の同時破壊を狙っている人の話を聞いても スコッと抜けるケースはあまり起きないそうで、 各遺伝子にin-delで変異が入るそうです。 nickaseの場合は、2箇所のnickを入れることで、 いわば突出末端の二本鎖切断を起こす、 という目的なのでゲノムの切れ目は1箇所になります。 NHEJの際に突出末端のぶんが削れたりして 数十bpの欠損になるのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.5457-8 - 2016/10/15 (土) 06:12:43 - ウイルス nickaseを使用する方法はオフターゲット効果のような非特異な切断を 押さえるためと理解しております。質問者様の目的とは異なるのでは。 nickaseはニックしか入れないので単独ではゲノム切断ができない。そこで2種類のガイドRNA発現プラスミド（それぞれ＋鎖‐鎖にアニーリング）を同時にトランスフェクションし、＋鎖‐鎖にそれぞれニックを入れることでゲノムを切断する。その際、効率的なゲノムの切断には2種類のガイドRNAの標的配列を20b以内に設計する必要があるとされています。 と理解していますがいかがでしょうか。 なお、この方法でいくつかKO細胞を拾っていますが、ゲノム編集は数bpから500bpの欠損および挿入があることをシークエンスで確認しております。（多くが数十bpの欠損でした）

(無題) 削除/引用 No.5457-7 - 2016/10/12 (水) 13:31:34 - 初学者 > 一方でそれならば最初から全exonもしくはできるだけ多くのexonを欠失するように二箇所のガイドで挟んだ方が機能喪失という意味では確実なような気もするのですが、効率等の問題で一概にそうとも言えないのでしょうか。 ダブルニッケースという手法のことだと思います。 確かにそうだと私は理解しています。 私の場合、そこまでしなくてもsingle gRNAでin-del mutationを起こさせKOを採ることににはこれまでのところ難渋していません。

(無題) 削除/引用 No.5457-6 - 2016/10/11 (火) 17:36:12 - AA 切断効率を上げるために複数のガイドを同時に使う方法は すでに論文もありますので効果的だと思われます。 一方で、イントロン領域にどんな発現制御領域を含んでいるか不明なため、 あまり大雑把に欠損させるのは危険だと言えると思います。 個人的には1箇所切断でin-delによるフレームシフトを願うのは 運頼みの感が強いので、もうちょっと工夫したほうが良いような気はします。

(無題) 削除/引用 No.5457-5 - 2016/10/11 (火) 13:28:38 - Shin お答え戴きありがとうございます。開始コドンを破壊すれば以降の翻訳が生じないので破壊の第一選択になるということですね。その次の候補が機能ドメインというのも理解できます。一方でそれならば最初から全exonもしくはできるだけ多くのexonを欠失するように二箇所のガイドで挟んだ方が機能喪失という意味では確実なような気もするのですが、効率等の問題で一概にそうとも言えないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5457-4 - 2016/10/10 (月) 13:46:09 - AA CRISPR-directやその他の支援ツールは、 ゲノム編集の効率(ON/OFF-target)を予測するものなので 必ずしも欠損させたい遺伝子の標的部位を 選ぶのにそれだけで十分とは言えないと思います。 もちろん、切れないガイドであれば場所があっていても 意味がないので必要であることは間違いないわけですが。。 実際にゲノム編集がうまくいっても機能が残る例は、 失敗例なので論文では見かけませんが、 自分の体験や、人から話もよく聞きます。

(無題) 削除/引用 No.5457-3 - 2016/10/08 (土) 23:05:00 - 小児科医師（ゆとり教育） 念のためですが、Crispr Direct（https://crispr.dbcls.jp/）はご存知ですよね？

(無題) 削除/引用 No.5457-2 - 2016/10/07 (金) 17:39:14 - AA 1箇所のガイドで編集する場合は、第一選択は開始コドンになると思います。 開始コドン以降にもメチオニンがあり、翻訳が行われそうな場合は 膜貫通ドメインや結合ドメインなどの機能ドメインが標的になると思います。 2箇所を標的にする場合は、特に長さに制限はなかったかと思います。 数百kbpでも抜けるので、遺伝子まるごと欠損すればよいのではないでしょうか

CRISPR/CAS9における標的エキソンの決定方法 削除/引用 No.5457-1 - 2016/10/07 (金) 13:23:12 - Shin 初心者につきご容赦下さい。 CRISPR/CAS9による遺伝子ノックアウトを検討中なのですが、標的とするexonはどのように決定すれば良いのでしょうか。また複数exsonを標的にするために二種類のsgRNAを挟むようにする方法もありでしょうか。その場合exon間の長さなどはどれくらいまでが適切なのでしょうか。 初歩的な質問で申し訳ございませんが、お教え戴ければ幸いです。

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