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(無題) 削除/引用 No.5459-9 - 2016/10/08 (土) 13:46:10 - おお 塩濃度が高いと、tx-114は低温でも分離してしまいますね。イオン交換使った精製だったら溶出された時の塩濃度はけっこう高いはず。

貴重な情報を有り難うございます。 削除/引用 No.5459-8 - 2016/10/08 (土) 12:56:38 - 大学院生です 引き続き、AP様、ご教示を下さり有り難うございます。 調べてみましたら、SigmaArdrichで、TritonX114が\5800/100mlで見つかりました。こちらの値段であれば、手が伸ばせそうです。 AP様がコメントされていた ＞Tx114はあらかじめ水抽出して不純物を除いた上、水飽和で使う この部分の値段がものすごく高いという事なのですね！ お金には換えられませんので、この手間をかける事で、少しでも経費を浮かせたいと存じます。 解決を押してしまいましたが、貴重なご意見を有り難うございました。

(無題) 削除/引用 No.5459-7 - 2016/10/08 (土) 11:53:45 - AP シグマのendotoxin removal solnでバカ高いですね。25 mLで\ 21500 ?!。 前処理、 水飽和処理済みと言うだけでこんなに取りますかね。 Tx114は100 mLで\8000くらいで買えるのに。しかも、水飽和したらLitterオーダーに相当するのに。

AP様、有り難うございます。 削除/引用 No.5459-6 - 2016/10/08 (土) 10:50:26 - 大学院生です AP様、詳しいご教示有り難うございました。 また、このトピ以外でTx114について皆様が詳しく解説されているトピもすごく参考に成りました。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2608 まずはお勧め頂きました試薬を購入し、プロトコールを参考に粛々と実験を遂行したいと存じます。 重ねて皆様に御礼申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.5459-5 - 2016/10/08 (土) 08:59:56 - AP どちらでもかまわないです。一旦沈殿して体積を減らしたほうが操作しやすいかもしれません。ただ精製スケールが大きければそれだけエンドトキシンの量が増えるでしょうから、それに応じて抽出回数を増やすといいかもしれません。 なお、Tx114はあらかじめ水抽出して不純物を除いた上、水飽和で使うと思いますが、確かそれで体積が10倍か20倍くらい増えるので、小容量で購入してもかなり使いでがあります。原液のまま加えるプロトコールもあると見つかると思いますが、その場合、少量で大部分の水層を吸収するので、あらかじめ沈殿して体積を減らしておかなくても、濃縮と沈殿が同時にできて一石二鳥かも。水抽出で不純物をのぞかないで使うことになるので、品質の高いものを選ばないといけないかもしれませんが、どうかな、今の時代の製品なら必要ないかも(原法はかなり古いものなので)。

ありがとうございます 削除/引用 No.5459-4 - 2016/10/08 (土) 04:42:03 - 大学院生です si様、おお様、ご教示ありがとうございます。 si様がお勧めして下さったSigmaの試薬もtritonX-114の試薬です。 長く使えそうなので、何とか頼み込んで購入したいと存じます。 お恥ずかしながら、無知の無知状態でして、大腸菌から抽出したプラスミドを直接トランスフェクションに用いる事にあまり疑問を抱いておりませんでした。（トランスフェクションする時の濃度を高くすると、細胞株によってはダメージが強いとは感じていましたが、試薬自体の毒性だと信じていました） 皆様にもうひとつお尋ねできれば幸いなのですが、たとえばmidi以上のクラスのキットで抽出した時は、エタ沈（イソプロ沈）してからtritonX-114でエンドトキシン除去されるのでしょうか？それとも、先にtritonX-114で処理してから、プラスミドの濃縮を行うのでしょうか？試薬を節約するためには、エタ沈で濃縮してからの方がよさそうなのですが。 （miniprep kitには、プロトコールにエタ沈のステップがないのでそのままtritonX-114で処理して良いですか？？）

(無題) 削除/引用 No.5459-3 - 2016/10/07 (金) 23:29:53 - おお triton x-114 endotoxin plasmid で検索してみてくだい

(無題) 削除/引用 No.5459-2 - 2016/10/07 (金) 16:48:52 - si sigma の endotoxin removal solutionは使ったことがあります。

プラスミド導入時のエンドトキシン除去について 削除/引用 No.5459-1 - 2016/10/07 (金) 15:01:50 - 大学院生です 平素より大変お世話になっております。 マウスES細胞に対し、10kbくらいの大きさのプラスミド導入を予定しています。現在使用しているプラスミド抽出キットは感受性でない細胞にはトランスフェクション可となっています。これまでのヒトの細胞を用いてプラスミド導入（8kb位）を行って参りましたが、特にエンドトキシン除去は行わず、なんとか実験を遂行できました。しかし、マウスES細胞に対し、効率的にプラスミドを導入する為には、エンドトキシン除去も行った方が良いのではないかと漠然と考えております。 エンドトキシンフリーのプラスミド抽出キットを購入するよりも安価でできる方法、お勧め試薬などございましたら、ご教示いただけないでしょうか？（エンドトキシン除去試薬の利用とか、エンドトキシン除去ビーズの利用など）あるいは、「意外とマウスES細胞は、エンドトキシンがあってもプラスミドの導入できたよ！」等の経験者からのご意見がございましたら、どうぞお願い申し上げます。

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