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(無題) 削除/引用 No.5469-10 - 2016/10/14 (金) 22:30:37 - おお 塩濃度よりアミノ酸のほうがクリティカルだと私も思います。カルボキシル基も阻害しますし、ニッケルへの結合に直接影響を与えますから。

(無題) 削除/引用 No.5469-9 - 2016/10/14 (金) 21:44:57 - mon Ni-NTAへの結合を阻害するアミノ酸はヒスチジンだけではないですよ(念のため）。 亜鉛イオン等も阻害しますし。

(無題) 削除/引用 No.5469-8 - 2016/10/14 (金) 21:40:06 - mon 私の経験では、塩濃度を振るくらいでは培地中のアミノ酸に勝てませんでした。。 10倍ほど希釈するか（回収率が落ちるので、時間をかけてカラムにロードする）か、透析（濃縮も兼ねて）など必要でしょう。 液量が多い場合は、イオン交換樹脂でざっくり粗精製・濃縮するのが効果的です。

(無題) 削除/引用 No.5469-7 - 2016/10/14 (金) 17:03:43 - kkk monさま、おおさま もちろん培地成分中のアミノ酸等がある程度阻害しているだろうという認識はあります。 まぁそのため塩濃度を...と思った次第でもありますが。 そもそも動物細胞の培養上清をNi-NTAで精製している論文を なかなか見つけられず(英語はあきらめているからでしょうか...) もうちょっと探してみます。

(無題) 削除/引用 No.5469-6 - 2016/10/14 (金) 14:56:50 - おお >培地中の大量のアミノ酸がNi-NTAへの結合を阻害していると思います。 私もそれを疑っています。

(無題) 削除/引用 No.5469-5 - 2016/10/14 (金) 13:20:48 - mon 培地中の大量のアミノ酸がNi-NTAへの結合を阻害していると思います。

(無題) 削除/引用 No.5469-4 - 2016/10/14 (金) 09:41:32 - kkk コメントありがとうございます。 おおさま ＞そこまでのそこってどこなんでしょうか？ 明確な値はありませんが現在精製してるサンプルの7割ぐらいが Eluteで得られたら良いなぐらいです 一応pH、イミダゾール濃度、インキュベート時間等の検討は 行いましたがどれも余り良い結果は得られず、、、 初学者さま ＞培養上清のpHは測定されていますか？ ＞培養上清だと若干酸性にふれるかもしれませんが、その際、ニッケルの荷電の状態で結合性が悪くなります 培養上清のpHを8.0に調製したりもしたのですが、むしろビーズにくっつかなくなってしまって検討を重ねている次第です。。。

(無題) 削除/引用 No.5469-3 - 2016/10/13 (木) 17:17:27 - 初学者 > 1割程度しか溶出されず殆どフロースルーに出ている状況でして、、、 培養上清のpHは測定されていますか？ 培養上清だと若干酸性にふれるかもしれませんが、その際、ニッケルの荷電の状態で結合性が悪くなります。

(無題) 削除/引用 No.5469-2 - 2016/10/13 (木) 16:45:31 - おお ＞Ni-NTAではそこまで濃縮出来るとは思って居ませんが、 そこまでのそこってどこなんでしょうか？ちゃんと溶出できる条件では相当濃いい濃度にすることも可能ですよ。数ミリグラム/mlとか。塩濃度の検討を報告した論文は確かに見つかるかどうか微妙ですが、高い塩濃度でやっている論文は見るける事ができるんじゃないかな。。。 まあ塩濃度の検討もしたらいいでしょうけど、色々ほかもいじっていかないといい条件が見つからないかもしれない。

Ni-NTAの塩濃度 削除/引用 No.5469-1 - 2016/10/13 (木) 14:18:15 - kkk 普段拝見させていただいています。 動物細胞の培養上清をNi-NTAでタンパク精製するのに いくつか条件検討をおこなっているのですが、 なかなか良い条件が見つかりません。 Ni-NTAではそこまで濃縮出来るとは思って居ませんが、 1割程度しか溶出されず殆どフロースルーに出ている状況でして、、、 そこで、ここのトピックで塩濃度を上げるとうまくいくといった記述がありましたが、 そういった検討をおこなった論文等があるのでしょうか。 自分だけで検討するなら話は早いですが、 条件を決めるのはボスでして、説得するために論文があればとても助かるのですが、 (ここのスレにあったからなどでは通じないですし。） もちろん自分でも探しましたが見つけることが出来ず、 ご教授いただけたらとおもって立てさせていただきました。 よろしくお願い致します。

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