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(無題) 削除/引用 No.5470-10 - 2016/10/23 (日) 17:37:25 - 院生 おお様 御意見まことにありがとうございます。 抗体は、ポリクローナル抗体です。 FLAG IPは、上司にも提案されましたので、ひとつの打開策としてやってみようとは思っております。 タンパク抽出に関してももう少し検討を加えます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5470-9 - 2016/10/19 (水) 14:15:41 - おお ポリクロですか、モノクロですか？ 特にモノクロならエピトープ部分の修飾や修飾のされ方で見えないとかも可能性がありそうです。また、抗体の検出感度はピンきりなので同じ検出感度で見ていない可能性もあると思います。FLAG IPでその抗体で見れるかどうかとかもやってみたらいいかもしれません。 Lysis Bufferは膜が可溶化すればいいだけなのでRIPAほど強いバッファーでなくてもいい気がします。そうすると抽出された蛋白に対するものの相対量が上る可能性がありますので、感度が稼げます。

(無題) 削除/引用 No.5470-8 - 2016/10/17 (月) 07:12:20 - 院生 ありがとうございます。 Cos-7自体はそのタンパクを発現しておりませんでした。 目的のものは分泌タンパクです。

(無題) 削除/引用 No.5470-7 - 2016/10/14 (金) 16:17:27 - おお Cos7がその蛋白を（トランスフェクションしない状態で）発現していないのかといういみです。 血漿ということは分泌淡白なのですか？そうすると少し感度を上げるためにやりようがあるかもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.5470-6 - 2016/10/14 (金) 15:19:17 - 院生 確かに、ポジコンに関してはマウス血漿を用いるべきでした。 恐縮ですが、「Cosのエンド」の理解ができませんでした。お教え頂ければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.5470-5 - 2016/10/14 (金) 14:44:24 - おお その前にポジコンをマウスにするべきではだったのでは？Cosのエンドはアクチンのことをいったのではありません。

(無題) 削除/引用 No.5470-4 - 2016/10/14 (金) 09:50:14 - 院生 お二方ともご意見ありがとうございます。 プラスミドに導入した配列は、シークエンスで間違いないことを確認しております。 目的タンパクに対する抗体に関して、エピトープはヒト由来となっておりますが、マウス、ラットへの適応も可とされておりました。プラスミドに導入したものはマウス由来の配列です。抗原部位は完璧な相同性はありませんでした。 ポジコンもヒト血漿を用いております。 マウス由来のエピトープで作製された抗体を用いなければいけないでしょうか。 元来、ヒトでの解析がメインであったため、現在用いている抗体を流用している形になっております。 ちなみにCos-7の内在性コントロール（アクチン）の発現は確認しております。

(無題) 削除/引用 No.5470-3 - 2016/10/13 (木) 23:30:02 - おお ポジコンはなんですか、Cosのエンドの発現はみれますか

(無題) 削除/引用 No.5470-2 - 2016/10/13 (木) 23:10:31 - たていす >タグにより、抗原抗体反応が阻害されることなどあるのでしょうか。 可能性ならあるかもね。 >あるいは他の原因があるのでしょうか。 その可能性のほうが高いんじゃないかな？ 面倒だろうけど、タグの直前に終止コドンをいれると、Xたんぱく抗体のウェスタンで見えるようになるだろうか？ということですね？ ｐCMV6の組み換えタンパクのほうに変異が入っているとか、そもそもマウス由来とヒト由来で抗原部位の配列が違うとか、そんな恐ろしい話じゃないよね？

Cos-7でのタンパク発現の確認に関して 削除/引用 No.5470-1 - 2016/10/13 (木) 18:49:00 - 院生 初歩的なことかもしれませんが、下記に関してお教え頂ければ幸いです。 現在、Cos-7にpCMV6（目的タンパクのC末端にMycタグ、DDK；FLAGタグ）をトランスフェクションし、目的タンパクを過剰発現を試みております。 タンパクをRIPA bufferで抽出し、抗DDK抗体でのウエスタンブロットでは予想される位置にバンドが得られました。一方で、目的タンパクに対する抗体を用いてのウエスタンではバンドが得られませんでした（ポジコンはバンドが得られております） タグにより、抗原抗体反応が阻害されることなどあるのでしょうか。あるいは他の原因があるのでしょうか。 お教え頂ければ幸いです。よろしくお願いします。

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