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ベクターを脱リン酸化せず、インサートはリン酸化 トピック削除
No.5473-TOPIC - 2016/10/14 (金) 06:06:30 - PH
非常に基本的な質問なのですが、頭がこんがらがってきたのでご助力いただけると幸いです。

通常ライゲーションではベクターをAP処理し、インサートは制限酵素処理したものなら処理後そのまま用いられるものの、2本のオリゴをアニールさせて制限酵素末端を作る、といった場合はリン酸化の必要があると思います。

そして突然疑問に思ったのですが、2種類の制限酵素で切ってAP処理していないベクターと、リン酸化したアニールオリゴセットをライゲーションした場合でも、問題なくライゲーションされますよね…？
リン酸基がついているのは5'末端のみであり、ベクターのインサートを受け入れる側にはリン酸基がないはずなので、くっつくはず…。

逆に、AP処理していない2種類の制限酵素処理ベクターと非リン酸化アニールオリゴセットではリン酸基不足でライゲーションは起こらない、そして、何らかの方法でベクターの切断点の3'末端をリン酸化した場合は、これは逆にリン酸化オリゴではリン酸基過剰でライゲーションは起こらず、リン酸化していないオリゴでしかライゲーションが起こらない…

…と、以上の考えで合っていると思うのですが、何か誤解している点があったらご指摘いただけるとありがたいです。
（最後の点は違うかな？という気もしてきました。DNA ligaseは「3'-OH + 5'-P」なんでしたっけ…？「3'-P + 5'-OH」は無理…？？）
　
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(無題) 削除/引用
No.5473-4 - 2016/10/14 (金) 09:01:12 - PH
連投すみません、やっぱり先ほどの2つ目の件は、起きますね。

一方（＝ベクター3' ＋ インサート5'）にしか目がいってませんでした。視点を横に移動させると、インサート3'-OH ＋ ベクター5'-Pになっているはずなので、起きるに決まっていました！やはり頭ぼけとりました。

色々ぐだぐだ書きましたが、明らかに間違っている点があればご指摘いただけると大変嬉しいです。

連投失礼致しました。

(無題) 削除/引用
No.5473-3 - 2016/10/14 (金) 08:52:15 - PH
Sさん
早速のご回答ありがとうございます。

1つ目の点、これが今知りたかったことなのでアドバイスいただけて何よりでした。

2つ目…あっ！普通に起きますね。頭ぼけとりました。書きたかったのは、「AP処理したベクター（100％反応が起きたと仮定して）と、未リン酸化処理オリゴセットでは、起きない」でした。


つまりこういうことでいいんですよね？

ライゲーションが…
3'-P + 5'-P ＝起きない
3'-OH + 5'-P ＝起きる
3'-P + 5'-OH ＝起きない
3'-OH + 5'-OH ＝起きない

制限酵素処理 ＝ 5'末端にPが残る
AP処理 ＝ 両末端ともPを奪い去る
PNK ＝ 5'末端にPをつける

3'末端にPを付ける方法はあるのかな…。暇な時に調べてみようと思います。


…あれすみません、やっぱり、指摘いただいた2つ目、ベクター側の3'端は制限酵素処理で-OHになっており、インサートの5'端も-OHなので、起きないんじゃないかな、という気がしてきました（ここでいう「ライゲーションが起きる」は、ベクターバックボーンとインサートのライゲーションで、欲しいプロダクトが得られる、という意味です）。
何か混乱してるかもしれません、時間を置いて改めて考えてみます…。

(無題) 削除/引用
No.5473-2 - 2016/10/14 (金) 08:28:50 - S
＞2種類の制限酵素で切ってAP処理していないベクターと、リン酸化したアニールオリゴセットをライゲーションした場合でも、問題なくライゲーションされますよね…？

もちろん起きますね。

>逆に、AP処理していない2種類の制限酵素処理ベクターと非リン酸化アニールオリゴセットではリン酸基不足でライゲーションは起こらない、

起きます

ベクターを脱リン酸化せず、インサートはリン酸化 削除/引用
No.5473-1 - 2016/10/14 (金) 06:06:30 - PH
非常に基本的な質問なのですが、頭がこんがらがってきたのでご助力いただけると幸いです。

通常ライゲーションではベクターをAP処理し、インサートは制限酵素処理したものなら処理後そのまま用いられるものの、2本のオリゴをアニールさせて制限酵素末端を作る、といった場合はリン酸化の必要があると思います。

そして突然疑問に思ったのですが、2種類の制限酵素で切ってAP処理していないベクターと、リン酸化したアニールオリゴセットをライゲーションした場合でも、問題なくライゲーションされますよね…？
リン酸基がついているのは5'末端のみであり、ベクターのインサートを受け入れる側にはリン酸基がないはずなので、くっつくはず…。

逆に、AP処理していない2種類の制限酵素処理ベクターと非リン酸化アニールオリゴセットではリン酸基不足でライゲーションは起こらない、そして、何らかの方法でベクターの切断点の3'末端をリン酸化した場合は、これは逆にリン酸化オリゴではリン酸基過剰でライゲーションは起こらず、リン酸化していないオリゴでしかライゲーションが起こらない…

…と、以上の考えで合っていると思うのですが、何か誤解している点があったらご指摘いただけるとありがたいです。
（最後の点は違うかな？という気もしてきました。DNA ligaseは「3'-OH + 5'-P」なんでしたっけ…？「3'-P + 5'-OH」は無理…？？）
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