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共発現させた時わずかに見かけの分子量が増加する原因を探る トピック削除
No.5480-TOPIC - 2016/10/17 (月) 17:32:43 - mars
目的蛋白質と常時活性化型Rasを共発現させた時わずかに見かけの分子量が増加したことを確認しているが、そのRasによる刺激を受ける部位や修飾を受ける部位がどこなのかを明らかにしたいです。特に実験手法とかありますか
 
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No.5480-7 - 2016/10/19 (水) 15:28:28 - おお
>タンパク修飾の種類
私が上げたのはほんの一部でしょうね。
Uniprotで蛋白を検索すれば、修飾が見つかっている部位、修飾が予測される部位など網羅的に示されています。

(無題) 削除/引用
No.5480-6 - 2016/10/18 (火) 16:41:15 - mon
あなたはタンパク修飾の種類をどれくらい知っていますか?その検出法をリストアップしてみれば?
なお、手持ちの情報によって選ぶ手法が変わるが、結果の確実性だけでなく、費用・労力(時間)も考えた方がよい。
まずは既知の修飾か否か探るか、MS/MSでいきなり挑むか?
最近は判明している修飾の種類も増え、その特異的検出試薬・手法も豊富になっている。たとえば、それらを使ってIP/western blotなどでシラミ潰しに行うか?
ただし、それぞれの手法の確実性を増すための注意点・コツがある。そのため、ひとつの手法だけで判定するのでなく複数の手法の結果から確定すべき。

(無題) 削除/引用
No.5480-5 - 2016/10/18 (火) 10:35:48 - 小言幸兵衛
なんでいきなり敬体→常体?

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No.5480-4 - 2016/10/18 (火) 10:02:31 - mars
修飾部位は触媒ドメイン間介在領域(461-769)が本修飾に必要十分な領域であることが明らかになったが、まずはどんな修飾かを同定したい

(無題) 削除/引用
No.5480-3 - 2016/10/17 (月) 17:55:13 - おお
精製して質量分析

もしあたりをつけるなら、リン酸化ならフォスファターゼとか
糖鎖ならそれを切る酵素とか。
膜にアンカリングするようだったら膜フラクション分離とか
アセチル化とかメチル化は抗体があるものは対応可能かと

部位の決定は質量分析が直接的ですが、部位が予測できるときはキャンディデートの部分にアラニンに置換してシフトが起こらない場所を見つけるというのもあり得るかと。

(無題) 削除/引用
No.5480-2 - 2016/10/17 (月) 17:53:55 - mon
大学院生ですか?レポートの課題ですか?
修飾を同定しないで、修飾部位を探す予定ですか?
タンパクのサイズはどの程度ですか?
局在はどこですか?膜タンパクですか?
修飾は何だと想定/推定していますか?それも不明ですか?データはありますか?

共発現させた時わずかに見かけの分子量が増加する原因を探る 削除/引用
No.5480-1 - 2016/10/17 (月) 17:32:43 - mars
目的蛋白質と常時活性化型Rasを共発現させた時わずかに見かけの分子量が増加したことを確認しているが、そのRasによる刺激を受ける部位や修飾を受ける部位がどこなのかを明らかにしたいです。特に実験手法とかありますか

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