全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.5499-18 - 2016/10/27 (木) 00:03:29 - おお >7.のlysis bufferで抽出出来る核蛋白質は多くないようにおもう。 この方法で上清の転写活性やスプライシング活性をみたり、EMSAなどのサンプルとして使ったりします。まあ変性条件で全タンパク質を抽出しても、このようなアッセイはできないからでしょうけど。 ５００mMのNaClが入っているのでクロマチンは緩んできてDNAが溶け出すか、半透明なゲル状になっているはずで（グリセロールや細胞の量に対するバッファーの量比にも依存しますけど）、たいての核タンパクの実験として受け入れられてはいます。 ただし、溶出されてない蛋白があると言うのはおっしゃるとおりです。 塩濃度が高いのでどの程度流すかによるかもしれませんが、電気泳動で若干解像度が落ちたり、流れが遅くなったりする可能性はあります。

(無題) 削除/引用 No.5499-17 - 2016/10/26 (水) 22:35:19 - あqwsでfrgtひゅいお 2.で使うはじめのほうのlysis bufferの中は、細胞を積極的に壊すような組成ではないので、もしこれで細胞質画分を得たいならば、ダンス型手動ホモジナイザー（手ですり潰すガラスのやつ）等、物理的な破砕が必要とおもいます。なので今みているものは、2.の過程で弱って死んだ細胞から漏れだしたようなものとおもいます。 0.5〜1% Triton　or NP-40　（核が沈殿して、それ以外は上清に分かれる。上清をよく細胞質画分とかいう人いるけどこれば正確でない）とかジギトニン（濃度忘れたけどかなり低い濃度で使うはず。細胞膜は溶けるがミトコンドリアは溶けないらしいのでまだ細胞質主体といえるかもしれない）を含む等張のbufferならば数回ピペッティングしてon iceでインキュベ―トするだけでいいとおもう。 7.のlysis bufferで抽出出来る核蛋白質は多くないようにおもう。単にイオン的DNAにくっついているようなのが溶けてくるけど、ガチで核プロテオームを構成してるようなのはあまり溶けてこない気がする。westernでみるならば、核画分（沈殿）を直接lysis bufferで溶かせばいいと思う。ほぼ全部抽出出来る。量によってはほどけたDNAで粘稠になるかもしれないけど、注射針通したり、超音波やればサラサラになるので解決する。 低張buffer処理は昔からよくやられてるけど、得られる核画分の純度は総じて低い。細胞骨格は核膜にくっついていたりするので、detergentがないと核画分にそれなりの量来るので純度は悪くなる。

(無題) 削除/引用 No.5499-16 - 2016/10/26 (水) 10:57:40 - さかむけ おおさん みなさんの意見を見ているとおかしなことが起こっていそうなので細胞の状態や扱いも注意しながら行いたいと考えています。 ご丁寧に教えていただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5499-15 - 2016/10/26 (水) 10:53:13 - おお Lysis bufferに懸濁するだけでGAPDHが出てきているようなので、それ以前の細胞の状態とか扱いとかにも何か問題点というか思わぬことが起こっているような気がしますので、その辺も色々確認しながらやるといいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.5499-14 - 2016/10/26 (水) 10:49:52 - さかむけ おおさん ありがとうごさいます。 Potter-Elvehjemは研究室にないのでニードルで破砕するという方法を試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.5499-13 - 2016/10/26 (水) 10:21:09 - おお >その時はやはりホモジナイザーペッスルなどで壊した方がよいでしょうか？ シュークロース入っていてもそうだけどなるだけマイルドな法が良いので、Potter-Elvehjemでやることが多いです。特にガラスの方をコーティングしてあるやつは核が壊れるような感じがしません。 量が少ないとか器具が揃えられないとか言うのであれば２３ー２５Gのニードルにシリンジを使って数回通すというてもあります。

(無題) 削除/引用 No.5499-12 - 2016/10/26 (水) 10:14:30 - おお 320 mM スクロースが入っているので細胞はしぼんでしまっているので、放置していても理論的には壊れないはず。

(無題) 削除/引用 No.5499-11 - 2016/10/26 (水) 10:12:45 - さかむけ おおさん 最初のバッファーはしっかりホモゲナイズしないなら低張なバッファーのほうがいいのでシュークロースない方がいいようなきがする。ただそれでも細胞が壊れるように何らかのホモゲナイズはしないと細胞膜がなかなか壊せない気がする。 スクロース抜きのバッファーで一度サンプル調整を行ってみたいと思います。 ありがとうございます。 その時はやはりホモジナイザーペッスルなどで壊した方がよいでしょうか？ 細胞質のフラクションを一度１３０００rpm（マイクロチューブ用遠心機で、たぶんだいたい１６０００gぐらいだとおもう）で５ー１０分遠心して完全にデブリとか除きそこねた核とか除いてみてはどうだろうか。 これもやってみたいと思いますが、以前時間で5-30分でやってみたところほとんど変わりませんでした。ｇは先生からやっても意味がないといわれたのでやらなかったのですがやってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.5499-10 - 2016/10/26 (水) 09:51:12 - さかむけ APさん 最初のLysisはバッファー入れて放置だけなんですか？それで破砕出来ていますか？ 以前はホモジナイザーペッスルで粉砕していましたが、細胞質にH3がでてしまうので行わなくなりました。しなくても細胞質にあるGAPDHなどは検出できています。 やはりホモジナイズした方がよいでしょうか？ その段階で顕微鏡で確認したことありますか？ 出発材料から死細胞は十分に排除できていますか。 顕微鏡で確認するとはスライドガラスなどに垂らして細胞を確認するということで大丈夫ですか？ 細胞質と核を分ける実験は研究室で初めてであるため、わからず未熟な質問で申し訳ありません。 PBSでWASHしているので十分取り切れていると思うのですが

(無題) 削除/引用 No.5499-9 - 2016/10/25 (火) 23:27:43 - おお >1% Triton X-100は核膜を壊さないことから、 核膜は可溶化されますが、核マトリクスと多分クロマチンは可溶化されません。１％ではいろいろな核タンパクが溶出されます。 デタージェントの代わりに塩濃度を３００mMほとに上げるとクロマチンが緩んでくるのでいろいろな蛋白が抽出されます。

(無題) 削除/引用 No.5499-8 - 2016/10/25 (火) 20:53:59 - TS ＞細胞質-> 1% Triton X-100で可溶性画分として 核とそれ以外を分けるなら簡易的にOKでしょうけど、 Triton入れると膜画分なども上清に入ってきますね。 セルスクレパーではがすだけでは、すべての細胞が破砕されないんじゃないかと。一般的にはダウンスあたりを噛ませると思います。 細胞質画分に核画分を入れたくないだけなら、もっと高速で回してしまえば入ってくることはないと思います。一方で、沈殿画分には核以外の画分がコンタミするかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.5499-7 - 2016/10/25 (火) 20:48:00 - 横 すみません、ちょっと驚いたので書き込みしてみました。 1% Triton X-100は核膜を壊さないことから、 細胞質-> 1% Triton X-100で可溶性画分として、不溶性の画分はSDS sample bufferを加えてsonication等した可溶性画分と思っていましたが、ほかにもいろんな方法があるんですね。

(無題) 削除/引用 No.5499-6 - 2016/10/25 (火) 16:13:59 - おお 最初のバッファーはしっかりホモゲナイズしないなら低張なバッファーのほうがいいのでシュークロースない方がいいようなきがする。ただそれでも細胞が壊れるように何らかのホモゲナイズはしないと細胞膜がなかなか壊せない気がする。 なんで細胞質フラクションに核タンパク質が出るのかよくわからないけど、細胞質のフラクションを一度１３０００rpm（マイクロチューブ用遠心機で、たぶんだいたい１６０００gぐらいだとおもう）で５ー１０分遠心して完全にデブリとか除きそこねた核とか除いてみてはどうだろうか。 それかLamin A/Cにマーカーを変えてみる？

(無題) 削除/引用 No.5499-5 - 2016/10/25 (火) 15:44:07 - AP Mg++が過剰に入っているから意味ないかもしれないけど、EDTAはEGTAにしたほうが理にかなっていると思います。

(無題) 削除/引用 No.5499-4 - 2016/10/25 (火) 15:42:24 - AP 入れ違いでしたね。 バッファーにMg++は入っていると。 最初のLysisはバッファー入れて放置だけなんですか？ それで破砕出来ていますか？　その段階で顕微鏡で確認したことありますか？ 出発材料から死細胞は十分に排除できていますか。

(無題) 削除/引用 No.5499-3 - 2016/10/25 (火) 15:33:19 - AP >バッファーを加え 組成の情報がないと意味ないぞ。 上清に核画分が漏れているということは核が壊れてるんですね。 ホモジナイザのクリアランスは十分に大きいでしょうか。 核膜はMg++存在下で硬く安定化すると言われていて、核をインタクトで分離するときに加えたりします。あなたのバッファーの組成に含まれていますか？

プロトコール 削除/引用 No.5499-2 - 2016/10/25 (火) 15:31:59 - さかむけ 現在使っているプロトコールです。 1．PBS wash ×2 回 2．Lysis buffer 添加 on ice. 3．スクレーパーで細胞を回収 4．インキュベート　15min on ice. 5.1000 g, 20 min, 4 ℃で遠心 6.上清を細胞質画分に 7.ペレットに Lysis buffer 添加 8.1000 g, 5 min, 4 ℃で遠心することで 1 回 wash 9.ペレットに Nuclear extraction buffer 添加 10.ホモジナイザーでホモジナイズ 11．18800 g, 10 min, 4 ℃で遠心 12．上清を核画分に バッファーの組成です。 Lysis buffer 10 mM HEPES (pH 7.9) 5 mM KCl 320 mM スクロース 1.5 mM MgCl2 0.1 mM EDTA Protease inhibitor Nuclear extraction buffer 20 mM HEPES (pH 7.9) 500 mM NaCl 1.5 mM MgCl2 0.1 mM EDTA 25 % グリセロール 0.5 % Triton X-100 Protease inhibitor

細胞質と核を分けたい 削除/引用 No.5499-1 - 2016/10/25 (火) 15:26:35 - さかむけ 現在、PC12細胞から核と細胞質を分離し、ウエスタンブロッティングでタンパク質の変化を見るという実験を行っています。 内部標準タンパク質として 細胞質はGAPDH 核では　Histon3 で確認しています。 (actinではなく、GAPDHを見ている理由は他のたんぱく質のバンドとかぶってしまうからです) 核と細胞質の分離はバッファーを加えホモジナイズして遠心して分けていますが、細胞質にHiston3のバンドが出てしまいます。 界面活性剤の濃度や遠心時間を変えるなど工夫をしましたが、うまくいきません。 いいアドバイスがあればよろしくお願いします。 ちなみに抽出キットは予算がないため使えず、遠心して分離する方法でうまくいった方がいれば教えてください。

全18件 ( 1 〜 18 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---