カラムの平衡化は10 CVとのことでしたが，
実際に平衡化後のpHは測定されましたか？
ないとは思うのですが，私は平衡化したはずだと思っていた
カラムから出てくる平衡化bufferのpHがずれていたことがありました。
あと気になった点は，
２５倍希釈をした後のタンパク量が1 μg/mLとのことでしたが，
500 mL流すとしたら，500 μgしかタンパク（夾雑含め）は使っていません。
目的タンパク質のおおもとの量が少なければ精製後に検出は大変になります。
ちゃんと実験しても，ロスはどうしても生じます。
大腸菌で発現させる場合と違って，自然界由来だとサンプル量は多くなっても
変なことではありません。（私は250 g前後の植物組織量を使っています）
アプライ時での，サンプルpHの調整も平衡化bufferで必ずしも行う必要もありません。濃い酢酸Na溶液かNaOHでpHを調整しても大丈夫です。（塩濃度は大切ですが）丁寧な論文だと調製の方法も書かれています
ここに書かれているぐらいなので，一般的な書籍やサイトは見ていると思いますが，あの手のものは大腸菌や培養組織で発現させている人向けのことが多いです。しかも，ポンプやFPLCなどを使った最新的な方法だったりします。
指導教官が精製経験者ならば,聞いたほうが確実にいいです。
本やネットよりもあてになります。
オープンカラムで野菜からの精製で
使用するbufferも私の実験と似ておりました。
失礼ながら，泥臭い事をやっている人がほかにもいるんだなと励まされました。
もしかしたら，フラクションを一本ずつ吸光度測定しているのも共通しているかもしれません。
頑張ってください。 |
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