Bio Technical フォーラム

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O型糖鎖 除去酵素 トピック削除
No.5512-TOPIC - 2016/10/31 (月) 14:34:31 - koko

いつもお世話になっております。

私は麹菌を対象に研究を行っており
タンパク質の解析を現在行っている学生です。

標的としているタンパク質について
糖鎖解析を行う過程で
まず、酵素処理の後にSDS-PAGEにてバンドシフトを検出する
操作を行ったのですが

・Endo Hf
・O-Glycosidase & Neuraminidase Bundle(以下ONB)

を用いた結果ONBについて全くバンドシフトが確認されませんでした。

つまり、O型の糖鎖が多く付加していないということが予想されますが
同じ部屋の人間がONBを―20℃保存の場所から室温の場所へ取り出し
どの程度かわからない時間放置したという情報が入り

このONBが現在活性を持つかどうか
ポジティブコントロールにて調べておきたいと考えました。


しかし、麹菌由来でO型糖鎖を持つタンパク質を調べて見つけることが
私にはできず困っております。

説明書にあるような標準タンパク質を使えば良いのですが
確認のためだけに買うのもどうかと思いますので
躊躇っているところであります。


そこで、(できれば麹菌由来で)O型糖鎖除去による
バンドシフトが観察されることが知られているタンパク質を
ご存知の方がいらっしゃれば教えていただけないでしょうか。

よろしくお願い致します。
 
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(無題) 削除/引用
No.5512-8 - 2016/11/01 (火) 17:24:35 - koko

おおさん

軽くですが文献を読んでみました。
β-GlcNAc特異的な凝集素レクチン?のようですが
今後の解析で役に立つかもしれません。
もっとよく勉強します。
有難うございます。

(無題) 削除/引用
No.5512-7 - 2016/11/01 (火) 17:18:24 - koko
サンショウウオさん


回答有難うございます。
こちらのサイトは利用したことはありまして
C末側にSer/thr rich な領域が存在し
そこへ付加が多くされているのではないかという予測でした。


Fetuinさん

回答有難うございます。
自分の対象としているタンパク質は推定分子量50kDaと
比較的10%程度のゲル濃度で分離が見やすいとは思っていたのですが
おっしゃる通り思ったよりもシフトが小さいのかもしれません。

違った方法で解析をすることを検討中であります。

またFetuinも、購入した方がよさそうですね。
アドバイス有難うございまいた。

(無題) 削除/引用
No.5512-6 - 2016/11/01 (火) 01:09:30 - おお
succinylated wheat germ agglutinin を使えばトータルライセートで評価できるかもしれませんね。
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3349994/

(無題) 削除/引用
No.5512-5 - 2016/10/31 (月) 22:47:10 - Fetuin
最近この分野の研究を始めました。

私もO型の糖鎖を切るためにO-Glycosidase & Neuraminidaseを使ってみました。酵素が間違いなく働いていることを証明するために、Fetuin(NEBで$68)を準備して、酵素で一晩反応させた後に4-12%のゲルに流してクマーシーで染めてみました。確かにバンドはシフトしてました(が、N-linkedを切ったときと違ってシフトはかなり小さいです。大きさ的に、もっと濃いゲルを使えば良かったか)。

そんなに高くないし、どの道酵素が生きてるかどうか調べる必要があるのであれば、買ってみても良いのではないでしょうか。


糖鎖のプロに聞いたところ、O-linkedは通常小さいから、SDS-PAGEでは差が見られないことも多い(けどマスにかければ見られる)という話でした。実際、自分の研究対象タンパクはそうでした(200KDaとそこそこ大きいからというのもあります)。

(無題) 削除/引用
No.5512-4 - 2016/10/31 (月) 15:53:35 - サンショウウオ
O型糖鎖付加サイトをアミノ酸配列から予測するサーバーとかあったりします。

www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/

(無題) 削除/引用
No.5512-3 - 2016/10/31 (月) 15:13:01 - koko
AspGDで簡単に調べられましたね汗

無学を晒してしまいお恥ずかしい限りです。

勉強になりました。有難うございました。

(無題) 削除/引用
No.5512-2 - 2016/10/31 (月) 14:56:32 - おお
www.aspergillusgenome.org/cgi-bin/GO/go.pl?goid=6493

この辺りでひろえないかな。

O型糖鎖 除去酵素 削除/引用
No.5512-1 - 2016/10/31 (月) 14:34:31 - koko

いつもお世話になっております。

私は麹菌を対象に研究を行っており
タンパク質の解析を現在行っている学生です。

標的としているタンパク質について
糖鎖解析を行う過程で
まず、酵素処理の後にSDS-PAGEにてバンドシフトを検出する
操作を行ったのですが

・Endo Hf
・O-Glycosidase & Neuraminidase Bundle(以下ONB)

を用いた結果ONBについて全くバンドシフトが確認されませんでした。

つまり、O型の糖鎖が多く付加していないということが予想されますが
同じ部屋の人間がONBを―20℃保存の場所から室温の場所へ取り出し
どの程度かわからない時間放置したという情報が入り

このONBが現在活性を持つかどうか
ポジティブコントロールにて調べておきたいと考えました。


しかし、麹菌由来でO型糖鎖を持つタンパク質を調べて見つけることが
私にはできず困っております。

説明書にあるような標準タンパク質を使えば良いのですが
確認のためだけに買うのもどうかと思いますので
躊躇っているところであります。


そこで、(できれば麹菌由来で)O型糖鎖除去による
バンドシフトが観察されることが知られているタンパク質を
ご存知の方がいらっしゃれば教えていただけないでしょうか。

よろしくお願い致します。

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